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1、分类号广西医科大学G u a n g x iM e d i c a lU n i v e r s i t y 硕士研究生学位论文密级编号胃癌患者肿瘤浸润树突状细胞数量和 表型变化的临床意义及其外周血树突 状细胞诱导的抗肿瘤作用学科专业：研究方向：导师姓名：研究生姓名：学号：肿瘤学树突状细胞与胃癌的关系葛莲英教授王娟2 0 0 3 2 0 0 8 4学位类型：科学学位二o o 六年五月英文缩写词表( A b r e v i a t i o n s )胃癌患者肿瘤浸润树突状细胞数量和表型变化的临床意义及其外周血树突状细胞诱导的抗肿瘤作用中文摘要【目的】胃癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，其预后与癌细胞
2、浸润深度、组织学类型、临床分期、淋巴结转移及肿瘤大小有关。近年来研究表明，树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ，D C ) 与肿瘤的发生发展关系密切，D C 是目前体内免疫系统中功能最强的抗原呈递细胞( a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l ，A P C ) ，在介导机体的免疫反应、抵御恶性肿瘤中发挥重要作用。D C 的数量减少和功能缺陷均可导致不能有效提呈肿瘤抗原、激活T 淋巴细胞诱导抗肿瘤免疫反应，致使肿瘤发生浸润、发展、转移。本研究主要探讨胃癌组织中肿瘤浸润树突状细胞( t t l m o ri n f i l t r
3、 a t i n gd e n d r i t i cc e l l ，T I D C ) 数量和表型变化与胃癌临床病理各指标之间的关系，并分析T I D C 浸润与胃癌细胞增殖与凋亡之间的关系，探讨D C 抗肿瘤的作用机制。同时探讨了能否从胃癌患者外周血D C 前体细胞诱导出功能正常、具有抗肿瘤作用的D C ，以期为胃癌D C 疫苗的临床应用提供实验依据。【方法】第一部分：采用免疫组织化学方法和脱氧核糖核酸转移酶介导的原位末端标记技术检测了5 3 例胃癌组织和2 5 例胃炎胃溃疡组织中D C 表面标志S 一1 0 0 蛋白、细胞增殖核抗原( p r o l i f e r a t i n g
4、c e l ln u c l e a ra n t i g e n ，P C N A ) 的表达及胃癌细胞凋亡指数( a p o p t o s i s i n d e x ，A I ) ，并分析了它们与胃癌临床病理各指标的关系。第二部分：采用流式细胞仪( F A C S ) 检测了2 7 例胃癌组织中T I D C 表面分子C D l a 、C D 8 6 、H L A D R 、C D 8 0 、C D 5 4 的表达，分析T I D C 的表型变化及其与胃癌进展的关系。并用R T - P C R 技术检测了几一1 0r n R N A 、T G F p 1 m R N A 及V E G
5、Fm R N A 三种免疫抑制因子在2 7 例胃癌及1 2 例慢性胃炎组织中的表达，分析T I D C 表型变化的原因。2第三部分：于体外用r h G M C S F 和r h I L - 4 分别从胃癌患者和正常人外周血D C 前体细胞诱导D C ，并用胃癌相关抗原冲击致敏。用相差显微镜观察D C 的形态学变化：流式细胞术检测胃癌相关抗原致敏前后D C 表面分子变化；E L I S A 法检测胃癌相关抗原致敏前后培养上清中I L 一1 2 含量；3 H T d R掺入法检测胃癌相关抗原致敏D C 刺激T 细胞增殖的能力；乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g
6、e n a s e ，L D H ) 4 小时释放法检测肿瘤抗原致敏D C 诱导T细胞增殖、分化为细胞毒性T 淋巴细胞( c y t o t o x i cT l y m p h o c y t e ，C T L ) 的杀伤活性。比较两种D C 的生长过程及功能有无不同。【结果】第一部分：1 胃癌组S 一1 0 0 C 中位数、P C N A 阳性率分别为9 、5 0 9 ，与对照组( 3 0 ，1 6 0 ) 相比，差异有统计学意义( P ，5 c m 的胃癌组其P C N A 阳性率为6 8 0 ，明显高于肿瘤直径 0 0 5 ) ，见表2 。1 6表2S - 1 0 0 + D C 与胃
7、癌临床病理各指标之间的关系变量例数Ps1 0 0 * D C 值一性别男3 91 0 0 00 0 59 0 01 0 0 0 0 0 57 0 01 4 5 0 妁0 57 0 01 2 0 0 0 0 58 o o1 2 0 00 0 54 O9 5 0 0 0 58 0 01 2 0 0，5 c m 的胃癌组其P C N A 阳性率为6 8 O ，明显高于肿瘤直径“ O 0 5 ) ，见表3 。2 5 触与胃癌临床病理各指标之间的关系5 3 例胃癌组织中A I 的范围为0 - 4 ，均数- 4 标准差为0 8 9 2 ：t - 0 8 2 6 ，中位数为O 6 ，不符合正态分布。越仅与临
8、床分期有关，临床分期为、期胃癌组，其A J 中位数为1 ，明显高于临床分期为I 、期的的胃癌组，后者的址中位数为0 4 ，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ，见表4 。表3P C N A 与胃癌临床病理各指标之间的关系表4A I 与胃癌临床病理各指标之间的关系2 02 6 胃癌细胞增殖与凋亡的关系5 3 例胃癌组织中，P C N A 阳性有2 7 例，阴性2 6 例，P C N A 阳性组的A J 中位数为0 9 ，明显高于P C N A 阴性组( O 4 ) ，差异有统计学意义，P 4 c m 的胃癌组P C N A 阳性率远高于直径4 c m 组，说明P C N A 指数与肿瘤大小有
9、关；而M a e d a 等 2 7 】的报道指出P C N A 指数与肿瘤大小无关。我们的实验研究发现，P C N A 在胃癌中阳性表达率与年龄、肿瘤大小、l 临床T N M 分期有关。、期胃癌组的P C N A 阳性率显著高于I 、I I 期胃癌组，差异有统计学意义。这与K o n n o 幽1 关于P C N A L I 与胃癌分期有关的结论是一致的，表明胃癌细胞随着病程的进展，其增殖活性大大增加，不仅加快了肿瘤的自身生长，同时使得肿瘤对机体的损伤进一步加剧。P C N A阳性率在一定程度上反映了肿瘤的分期，为I 临床诊断提供了依据。另一方面，我们还检测到，随着肿瘤的直径增大，P C N
10、 A 阳性率显著升高，这也进一步说明P C N A 反映了肿瘤组织的增殖活性，提示增殖活性高的胃癌组织其生长加快，病情进展快。这与N i s h i d a t 2 9 1 的研究结果相一致。而本实验结果显示，P C N A 阳性率与浸润深度及组织分化等无关，与其他学者研究结果不一致【3 0 ，分析原因可能为：统计的标准不同，本次实验以P C N A染色3 、4 级为P C N A 表达阳性，使实验结果的精确度受到一定程度的影响；本实验样本数不够大( 5 3 例) ，使分期和分类的误差增大：体内外研究方法及研究材料间的差异( 冰冻切片，细胞培养，档案资料，组织新鲜程度等) 也可导致结果的不一致
11、；不同环境危险因素的接触和不同种族遗传性变化的特殊性造成不同人群之间的差异等。至于P C N A 阳性率与年龄有关，其原因不明。综上所述，本研究提示：P C N A 可作为反映胃癌生物学行为的一个指标，对预测胃癌进展具有重要意义。同时，由于P C N A 的变化反映了肿瘤细胞内D N A 复制的周期性变化，因此临床上可根据肿瘤组织P C N A 的表达情况合理应用抗癌药物和采取某些干预措施抑制胃癌细胞增殖活性，可减少胃癌的转移和复发，提高疗效。肿瘤的发生是一个多因素、多基因参与的复杂过程，其不仅与细胞增殖有关，亦与细胞凋亡有关，凋亡是细胞自身程序化死亡的生理性过程，与细胞增殖一样是生命的正常组
12、成部分之一。细胞凋亡与增殖失衡与肿瘤的发生密切相关 3 1 - 3 2 】。多数研究表明，胃癌中增殖和肿瘤生物学行为、预后的关系比凋亡要密切，而凋亡相对意义较小。I n a d a 3 3 1 用流式细胞检测8 4例胃癌组织T U N E L 标记的凋亡细胞，M 与肿瘤浸润深度、淋巴结转移均无关系。K o s h i d a l 3 4 1 研究了8 2 例胃癌组织的址，结果发现早期胃癌与进展期胃癌的m 差异有统计学意义，而不同大小、不同分化、有无淋巴结转移组间m 无差异，并且高低A I 组生存率无差异，认为A I 并不能直接反映肿2 4瘤的生物学行为。然而近年来许多关于肿瘤凋亡与增殖关系的研
13、究表明，细胞的凋亡与增殖是紧密偶联的。增殖越旺盛，凋亡指数越高。在高增殖和更具侵袭性的肿瘤中，常观察到高的凋亡率。如I k e g u c h i E 3 5 1 检测9 7 例进展期胃癌( T a N o M o ) ，发现6 7 L I 与越有很好相关性。K o s h i d am 】贝U 发现A J 与M I ( 有丝分裂计数) 呈正相关。我们采用T U N E L 法检测了5 3 例胃癌组织中胃癌细胞的凋亡情况，结果显示临床分期为、期的胃癌组A J 明显高于临床分期为I 、I I 期的胃癌组，说明A J 与临床分期有关。本研究还分析了S 1 0 0 + D C 浸润与P C N A
14、、A I 之间的关系，结果显示，A J 与P C N A 呈正相关，即癌细胞增殖越快，凋亡癌细胞亦较多，这与陈金明等【3 6 】的研究结果一致。S 1 0 0 + D C 浸润与m 呈负相关，即D C 高浸润组的A I 低于D C 低浸润组，即S 1 0 0 + D C 浸润越少，其越越高，分析其原因可能有二，一是凋亡和增殖关系密切，增殖越旺盛，凋亡指数越高，由于临床分期较差、D C 低浸润的胃癌组其P C N A 阳性率较高，故其A I 也较高。二是有时恶性程度高，进展快的肿瘤由于缺血、缺氧也会导致凋亡增加。所以高触对肿瘤的生物学行为的影响如何需要看凋亡是由于何种因素引起，这也是目前址对肿瘤
15、的生物学行为及预后的影响结论不同的原因。要确切得出凋亡在胃癌中的意义还需要大样本量、进行多因素对比研究。S 1 0 0 + D C 浸润与P C N A 呈负相关，D C 高浸润组的P C N A 阳性率为3 7 9，明显低于D C 低浸润组的P C N A 阳性率( 6 6 7 ) ，提示胃癌组织中1 r I D C可以抑制肿瘤细胞的增殖，这可能是机体D C 的抗肿瘤机制之一。综上所述，本部分研究证实了胃癌组织中T I D C 数量减少，D C 浸润的程度与胃癌的临床病理指标密切相关；抑制胃癌细胞增殖可能是D C 的抗肿瘤作用机制之一。第二部分胃癌组织中T I D C 表面分子的表达及原因分
16、析有研究报道，肿瘤细胞可以分泌m 1 0 、T G F p l 、V E G F 等免疫抑制因子，抑制D C 成熟，使D C 表面M H CI I 类分子、共刺激分子、粘附分子等减少，导致D C 递里抗原的能力降低，从而使抗原特异性T 细胞不能杀伤肿瘤细胞，导致肿瘤生长、转移。因此，肿瘤组织中的浸润D C ( T I D C )作为直接与肿瘤细胞相接触的D C ，其生物学活性反映了宿主防御机制的状态，将直接影响到肿瘤的进展，对于肿瘤微环境中D C 功能的研究将有助于我们了解肿瘤的免疫逃逸机制。本研究对2 7 例胃癌组织中分离获得的T I D C 进行了流式细胞仪检测，分析其表面分子C D l a 、C D 8 6 、H L A D R 、C D 8 0 、C D 5 4 的表达情况及与临床分期的关系，并用R T - P C R 的方法检测了2 7 例胃癌组织和1 2 例慢性胃炎组织中三种免疫抑
