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1、河南科技大学硕士学位论文喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立姓名：宋春美申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张改平;侯玉泽20091201摘 要 I论文题目：喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立论文题目：喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立 专 业：生物化学与分子生物学 专 业：生物化学与分子生物学 研 究 生：宋春美 研 究 生：宋春美 指导教师：张改研究员 侯玉泽教授 指导教师：张改研究员 侯玉泽教授 摘 要摘 要 喹乙醇（Olaquindox，OLA）是化学合成的喹噁啉类广谱抗菌药物，具有蛋白同化作用，可提高饲料转化率与瘦肉率，
2、促进动物生长，也可用于预防和治疗细菌感染性疾病。但是在生产实践中，喹乙醇的不规范使用不仅直接危害动物机体的健康，还可以通过食物链对人类健康造成极大的危害。随着科学技术的发展和国家的重视，其检测方法也不断发展。目前已有电化学分析法、光谱法、色谱法、液相色谱-质谱联用技术、免疫分析技术等检测方法。为了建立快速、灵敏的喹乙醇残留免疫学分析方法，本研究在分析喹乙醇免疫学特性的基础上，运用单克隆抗体技术制备了喹乙醇单克隆抗体，并组装了间接竞争ELISA试剂盒。主要研究结果如下： 1喹乙醇人工抗原的制备与鉴定 琥珀酸酐法合成衍生物喹乙醇-半琥珀酸酯（OLA-HS）；活化酯法合成全抗原 OLA-BSA、OL
3、A-OVA，紫外分光光度法（UV）、凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定；用 OLA-BSA 免疫 BALB/c 小鼠，间接 ELISA 测定多抗血清效价，间接竞争 ELISA 鉴定其敏感性、特异性。紫外扫描图谱显示合成的人工抗原的最大吸收峰发生偏移，证明偶联成功，并测得 OLA-BSA、OLA-OVA 中 OLA-HS 和BSA、OVA 的分子结合比分别为分别为 17.1:1 和 12.4:1；SDS-PAGE 结果表明BSA 的泳动速度大于 OLA-BSA，说明 OLA-BSA 的分子量大于 BSA，进一步说明 OLA-HS 与 BSA 偶联成功。3# 小鼠抗血清的效价最高，对 OLA 的半数
4、抑制浓度（IC50）为 58.923 ng/mL，与卡巴氧的交叉反应率为 1.841%，与其他药物无交叉反应。通过实验获得了高价、敏感、特异的多克隆抗体（pAb）。 2喹乙醇单克隆抗体的制备及免疫学特性的鉴定 间接 ELISA 和间接竞争 ELISA 选择细胞融合备用鼠；杂交瘤技术制备喹乙醇单克隆抗体（OLAmAb），并对其效价、亲和力、敏感性、特异性、亚型进行鉴定；体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。筛选出了 2B1、4F5、4E12、5B5、5E5 五株敏感特异的杂交瘤细胞；鉴定单抗亚型均为 IgG1；细胞培养上清间接 ELISA 效价在 1:3.01021:1.28103之间，4E12 细
5、胞株制作的腹水效价为1:5.12105，OLAmAb 亲和常数 Ka 为 3.751010L/moL，对 OLA 的 IC50为摘要 II1.66ng/mL；与卡巴氧的交叉反应率为 5.19%，与其它类药物无交叉反应。通过试验获得了高效价、敏感、特异的 OLAmAb，可用于动物性食品中 OLA 的残留检测的免疫学试验。 3喹乙醇残留免疫学快速检测方法的建立 根据酶联免疫吸附试验原理，应用 OLAmAb 研制出 OLA 残留快速检测间接竞争 ELISA 试剂盒（OLA-Kit），OLA-Kit 的标准曲线呈 S 型，符合 4 参数logit 曲线拟合，最低检测限为 0.126g/L，半数抑制浓度
6、 IC50为 1.66ng/mL，平均批内和批间变异系数小于4000 mg/L 1.2.2 蓄积毒性蓄积毒性 蓄积毒性指当动物机体与外来化合物反复接触或染毒时，吸收量大于排泄量或毒性作用多次累加所致功能性或结构性损害。蓄积毒性可利用蓄积毒性试验初步评价，主要是通过亚慢性毒性、慢性毒性和毒带动力学的研究来阐明。大量研究均表明喹乙醇对动物机体具有中度至明显的蓄积毒性。 徐士新等16在喹乙醇蓄积毒性试验中测得喹乙醇对小白鼠的蓄积系数为33.3，为中度至明显蓄积。尹荣焕等17、邹德妍等18以1/5LD50喹乙醇连续30d灌喂小鼠，发现血液中AST、ALT的活性和Gre、BUN含量均升高，出现化学性肝细
7、胞损伤，线粒体、内质网变性，肝细胞坏死；肾小管上皮细胞高度肿胀、变性、脱落，肾小球囊腔变狭窄，足细胞部分融合，证实了喹乙醇对肝肾的器质性损害。 董漓波等19经试验得喹乙醇对石岐杂鸡的蓄积系数为3.24，为中度蓄积。陈莲等20按每天15mg/kg体重的剂量连续喂养艾维茵鸡6周，发现喹乙醇能影响红细胞膜和肝线粒体上的生物膜磷脂酶A2活性和膜磷脂含量，从而引起生物膜损河南科技大学硕士学位论文 4伤，甚至细胞死亡。高洪等21利用显微技术发现艾维因鸡经喹乙醇蓄积中毒后可导致严重的肝肾损害。 朴金日等22按照100mg/kg和200mg/kg的添加剂量连续饲喂断奶仔猪39d，发现喹乙醇对其生长和肝肾功能均
8、有影响，表现出了一定毒副作用。 汪开毓等23采用剂量定期递增法测得喹乙醇在鲤鱼体内的蓄积系数为1.451.9，为明显蓄积。他们在鲤鱼亚急性喹乙醇中毒的血液生化指标研究24中发现，中毒鱼表现为特征性的“应激性出血综合症”，且Hb含量与RBC数量减少；红细胞SOD酶活性降低；血清AST、ALT活性升高，血清K+浓度升高，Na+浓度降低。 1.2.3 遗传毒性遗传毒性 遗传毒性是指环境中的理化因素作用于有机体，使其遗传物质在染色体水平、分子水平和碱基水平上受到各种损伤，从而造成的毒性作用。Ames试验、哺乳动物体外诱变细胞试验、哺乳动物体内诱变试验和基因突变试验，均证实了喹乙醇有致基因突变的作用。
9、Yoshimura等25用Ames试验证实了不论加或不加哺乳动物微粒体酶(S9)，喹乙醇在2.5、5、10、15g/mL剂量下，对TA98和TA100菌株都有诱变性，且TA100更敏感，回复突变率更高。王树槐26报道，喹乙醇的受试剂量在大于6.6g/mL时，即可对CHL细胞染色体产生畸变作用。Scheutwinkel-Reich等27用喹乙醇处理中国仓鼠细胞V79，发现姐妹染色单体互换(SCE)频率增加，且存在剂量反应关系。王树槐等28发现口服750mg/kg剂量的喹乙醇即可诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核率达到36.5%。尹容焕等29试验发现，给小鼠灌胃喹乙醇，剂量超过120mg/kg
10、时，小鼠骨髓微核率会显著升高，网织红细胞数显著降低；当喹乙醇的作用剂量为1200mg/kg时，红细胞数较对照组显著降低，提示大剂量喹乙醇不仅具有遗传毒性，还可能会抑制小鼠骨髓的造血机能，导致其贫血。郝利华等30研究发现喹乙醇可诱发质粒pSP189靶基因突变，主要表现为基因点突变和连续缺失，且以点突变为主，占突变总数的70%。王德成等31提取1日龄艾维因肉鸡体内的肝脏mtDNA，运用PCR-SSCP技术研究了喹乙醇对mtDNA的致突变效应，发现试验组mtDNA的tRNAleu(UUR)4007位的C突变为A。 大剂量添加喹乙醇时会对动物繁殖产生不良影响。徐韵等32进行的斑马鱼胚胎发育试验结果表明
11、，96h EC50为221.20mg/L，具有明显的致畸效应；喹乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响集中表现在胚胎发育后期，除卵凝结、停止发育以外，高剂量组还出现心脏部位水肿，鱼苗腹部红肿、侧卧等。姜卓等33发现小鼠生第 1 章 文献综述 5精细胞Bax蛋白的表达随着喹乙醇浓度的升高而呈显著变化。尹荣焕等34进一步证实了喹乙醇可以诱导小鼠睾丸生精细胞发生凋亡。 1.2.4 免疫毒性免疫毒性 免疫毒性是指无论最终结果是否改变了宿主的抵抗力，只要对免疫系统或者其组成部分有害的毒性作用。 汪开毓等35在喹乙醇对鲤鱼的慢性毒性试验中发现，给药后4590d，脾窦充血明显，且发生出血，淋巴细胞相对减少，整个脾脏内大
12、量含铁血黄素沉着；黑素巨噬细胞中心体积增大，巨噬细胞内吞噬大量异物。尹容焕等36发现，随着喹乙醇剂量的增大小鼠胸腺指数和脾指数呈递减趋势，C3b花环率也逐渐减少，说明大剂量喹乙醇可能会抑胸腺的发育，抑制机体的红细胞免疫功能，降低机体的非特异性免疫功能。 1.2.5 生态毒性生态毒性 兽药生态毒性是指动物在使用药物以后，药物以原形或代谢物的方式从粪、尿等排泄物进入生态环境，或者渔场水体直接用药，造成土壤环境、表层水体、水生和陆生生物的兽药残留蓄积，进而引起的毒性。 陈海刚等37采用赤子爱胜蚓体内的纤维素酶和SOD酶作为生物标志物来评价喹乙醇对土壤环境生态系统的潜在影响和危害，试验证明喹乙醇对纤维
13、素酶活力影响不明显，但对SOD酶活力有较明显的促进作用。高玉红等15通过喹乙醇对蚯蚓的急性毒性效应以及对其生长的影响的研究，证实了喹乙醇能引起蚯蚓的形态病理变化，对生态环境构成潜在危害。Wollenberger等38用喹乙醇对甲壳细水蚤进行试验，发现喹乙醇对其有较强的急性毒性，对水环境有潜在的不良作用。 1.3 喹乙醇的检测方法喹乙醇的检测方法 1.3.1 电化学分析法电化学分析法 电化学分析法包括：电位分析法、电导法、极谱分析法、电位滴定法。在电位分析法中，溶出伏安法是测定饲料样品元素的一种较为先进的电化学分析方法。Vra Stara 等39采用吸附溶出伏安法对喹乙醇进行分析测定，测得喹乙醇
14、的检测限为 710-1mol/L。 河南科技大学硕士学位论文 61.3.2 光谱法光谱法 光谱法是光学分析法的其中一类，是指基于物质与辐射能作用时，对由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行测量分析的方法。 范伟军40用紫外分光光度法检测复合制剂中喹乙醇的含量，先将喹乙醇分离出来，并稀释若干倍，在 382nm 波长处测定吸收度，并与标品对比测回收率，结果表明喹乙醇的平均回收率为 99.4%，变异系数符合要求，被测溶液 6h内稳定，表明溶液中的共存组分不干扰含量的测定。此法分析设备简单，操作简便，快捷，结果准确。 叶广茂等41利用中药在 368nm 和 4
15、28nm 为等吸收点的特点，采用等吸收点法测定兽药克痢顿中的喹乙醇含量，平均回收率为 99.6%，在标示量范围内测得的样品结果准确度很高。 刘同民等42以甲醇为溶剂，采用一阶导数分光光度法，测定多种组份的复方喹乙醇制剂中的喹乙醇含量，测定浓度在 530g/mL 范围内线性关系良好(r=0.9997)；平均回收率为 99.6%，相对标准偏差（RSD）为 1.28%。 王文杰43发现预混添加剂中的喹乙醇含量与近红外光谱特征吸收值之间有着近似直线的函数关系，用近红外光谱分析得到的定标方程有相当稳定的估测效果和较好的估测精度。 1.3.3 色谱法色谱法 色谱法也叫层析法，是利用混合物中待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来实现分离的一种技术。色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法（HPLC）等，用于检测样品中喹乙醇残留的主要是薄层色谱法和高效液相色谱法。 刘安南44采用薄层色谱法鉴别中西复方制剂中喹乙醇成分时，选用醋酸乙酯-丙酮-乙醇（5:4:1）为展开剂，测得样品与对照品所显斑点位置、颜色一致，且斑点清晰，专一性强，Rf值为0.48。 叶红丽等
