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1、泸州医学院硕士学位论文IP及DG信使通路在UTP对猪冠状动脉平滑肌细胞STOCs调节 中的作用姓名：潘雪申请学位级别：硕士专业：生理学指导教师：曾晓荣20060501I P 3 及D G 信使通路在U T P 对猪冠状动脉平滑肌细胞S T O C s 调节中的作用水 摘要目的：大电导钙激活钾通道( 1 a r g e c o n d u c t a n c ec a l c i u m a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l s ，B I G a ) 在调节血管平滑肌舒张机制中起着重要作用。由胞内肌浆网( s a r c o p l a
2、s m i cr e t i c u l u m ，S R ) 上兰诺定受体( r y a n o d i n er e c e p t o r ,硒，R ) 通道开放产生的钙火花( C a 2 + s p a r k s ) 可使局部钙浓度迅速升高，激活胞膜上许多与之相邻的B K c a 通道产生自发性瞬时外向钾电流( s p o n t a n e o u st r a n s i e n to u t w a r dc u r r e n t s ，S T O C s ) ，使膜超极化，抑制电压依赖性钙通道( v o l t a g e d e p e n d e n tC a 2 +
3、c h a n n e l s V D C C ) ，减少钙内流，负反馈抑制平滑肌的收缩。由于生理状态下B a 通道对C a 2 + 的亲和力低，而全胞性钙浓度较低且变化有限，因此由钙火花激活邻近的部分B K c a 通道开放产生的S T O C s在血管平滑肌收缩舒张的调节中发挥着极为重要的作用。血管平滑肌中，R y R 产生的钙火花可激活相令啪B I G a 通道产生S T O C s 被大家所公认。但近年来的研究显示，三磷酸肌醇( i n o s i t o l l ，4 ，5 一t r i p h o s p h a t e ，I P 3 ) 与甘油二酯( d i a c y l g
4、l y c e l ，D G ) 作为胞内重要的第二信使在S T O C s 产生及调控中也发挥了重要的作用，而具体机制尚不十分清楚。另外，二者在收缩或舒张物质对于S T O C s 的调控中分别发挥着怎样的作用还存在许多争论，需要进一步研究。迄今已发现1 0 0 多种细胞外因子可通过磷脂酶C O h o s p h o l i p a s eC ，P L C )产生的I P 3 及D G 信使通路调节细胞功能，因此深入研究双信使通路对B K c a通道的调节机制具有重要的生理意义。本课题以与人心脏构成相似、容易获取的猪冠脉平滑肌为研究对象，观察猪冠状动脉平滑肌细胞上的S T O C s ，：
5、l = 国家自然科学基金资助项目( N o 3 0 3 7 0 5 2 7 )以及三磷酸尿苷( u r i d i n e5 - t r i p h o s p h a t e ，u I P ) 介导产生的I P 3 与D G 在u r P对S T O C s 调节中的作用，并初步探讨其机制。为深入认识血管舒缩及调控机制提供实验依据。方法：分离出猪冠状动脉，剔除外膜和内膜，保留平滑肌层，将其剪成2 5 m m 的组织块，放入酶液经过酶解后获得单个平滑肌细胞，分离韵细胞在8 小时内使用。取急性酶分离的平滑肌细胞置于浴液中，采用膜片钳技术记录全细胞电流。所得电流通过膜片钳放大器( C E Z 2
6、3 0 0 )放大，滤波( 2 K H z ) 后输入计算机，用p C L A M P 9 0 软件系统进行数据采集；应用M i n iA n a l y s i s 6 0 软件系统进行数据分析。本实验以全细胞穿孔膜片钳( p e r f o r a t e d - p a t c hc l a m p ) ) 亨式记录猪冠状动脉平滑肌细胞膜上的S T O e s ，将测试电位( t e s tp o t e n t i a l ，T P ) 保持在一3 0 m V ，观察U T P 介导产生的I P 3 与D G 在U T P 对S T O C s 调节中的作用。结果：实验条件下记录到的S
7、 T O C s 随电压的增加而增加，有明显的电压依赖性( n = 5 ) ，并能被B K c f i l 直道的特异性阻断剂卡律蝎毒素( c h a r y b d o t o x i nC h T X ) 完全阻断( n 书) 。S m MR y R 的特异性激动剂咖啡因( c a f f e i n e ) 可激活S T O C s ( n = 5 ) ；5 0 0 MI 哼R 的特异性阻断剂兰诺定( r y a n o d i n e ) 可使S T o C s 的幅度和频率均减小直至完全消失( n = 1 6 ) ，在此基础上加入5 m M c a f f e i n e 未见恢复(
8、 n - - 9 ) 。 4 0 B M 的U r P 可使S T O C s 的幅度与频率明显增j J l ( 2 3 5 3 2 5 5 p A ，0 2 1 6 7 0 0 2 1 7 H zv s4 0 7 6 5 7 5 p A ，0 3 6 9 5O 0 3 5 8 H z ，n = 1 6 ，P l v M 时才可使之充分激活) 【9 1 ，而此状态下全胞性钙浓度较低且变化有限【1 0 1 ，所以由局部胞内钙释放激活邻近B K c a 通道开放产生的S T O C s 在血管平滑肌舒张调节中发挥着极为重要的作用。三磷酸肌醇( i n o s i t o ll ，4 ，5 - t
9、r i p h o s p h a t e ，I P 3 ) 与甘油二酯( d i a c y l g l y c e l ，D G ) 是细胞内重要的第二信使，多种激动剂与质膜上的特异性受体结合后可激动磷脂酶C ( p h o s p h o l i p a s eC ，P L C ) 使磷脂酰肌醇4 ，5 二磷酸( p 】删啦l 融脚l i o 鳓 4 , 5 - b l p h o s p h a t e , “m 2 ) 水解产生I P 3 与D G 。前者可与肌浆网或内质网上的I P 3 受体( I P 3r e c e p t o r , I P 3 R ) 结合释放钙离子使胞内钙
10、离子浓度升高，从而激活多种钙依赖的反应。D G 则能激活蛋白激酶C ( p r o t e i nk i n a s eC ，P K C ) ，通过对底物蛋白磷酸化而影响细胞的功能。近年来的研究显示二者在平滑肌细胞S T O C s 的产生及调控中也发挥着重要的作用。在胃肠平滑肌上抑制性神经递质作用于细胞膜引起I P3 j 依赖机制的钙释放可导致S T O C s 的激活和超极化【1 3 1 4 l 。在鼠门静脉细胞上I P 3 可诱发S T O C s t l 5 1 。鼠脑动脉平滑肌上缩血管物质U T P 增加钙火花和S T O C s的作用可能是由I P 3 所介导的【1 6 】。佛波酯
11、( P K C 激活剂) 可以使大鼠脑动脉及尾动脉平滑肌S T O C s 频率幅度有所下降 1 7 , 1 8 。P K C 的激活剂对培养或急性酶分离平滑肌细胞B K c a 通道的抑制也有报道 1 9 , 2 0 1 。另外，最近也有人发现在大鼠肺动脉平滑肌细胞中P K C 可激活B K c a 通道 2 1 1 。上述研究都表明I P 3 和D G - P K C 信使途径与B a 通道介导产生的S T O C s 之间存在着一定的内在联系。目前，国内外的研究大多集中在R y R 与钙火花，钙激活钾通道之间关系的研究上。由R y R 激活产生的钙火花可通过激活胞膜上B K c a 通道
12、产生S T O C s 使膜超极化，负反馈抑制平滑肌的收缩【4 2 1 ，已被大家所公认。而对于I P 3 与D G 信使通路是如何对B K c a 通道介导的S T O C s 进行调控的，g y R 作为调控S T O C s 生成的重要因素在二者对B a通道调控中有无作用，国内还未见报道，将是下一步研究的热点。近年来磷脂酶和磷脂酰肌醇激酶的信号转导通路越来越受到人们的重视，迄今已发现1 0 0 多种细胞外因子可通过P L C 产生的I P l 3 及D G 信使R通路调节细胞的功能。因此深入研究双信使通路对B K c a 通道的调节机制在心血管系统对于研究心肌和平滑肌收缩舒张机理，阐明多
13、种心血管疾病的发生发展规律等都具有重要的意义。本研究将在本课题组国家自然科学基金课题前期工作的基础上，应用膜片钳技术进行I P 3 与D G 对B K c a 通道所介导的S T O C s 作用的研究。由于生理情况下二者主要由细胞外因子通过P L C 水解P I P 2 产生，再者尚缺乏可穿膜的I P 3 及D G 的运输不便，因此我们选用了t r r p ( 与胞膜上受体结合后可激动磷脂酶P L C p ，水解P I P 2 产生D G 与I P 3 ) 作为I P 3 和D G 的前体物质来观察它对B K c a 通道所介导的S T O C s的影响，从而进二步阐明二者对B K c a
14、通道所介导的S T O C s 的作用，并初步探讨其作用机制，为下一步实验奠定基础。材料与方法1 实验动物选用体重1 0 0 1 5 0 K g 雄性家猪，取于泸州屠宰场。2 主要实验试剂2 1 实验溶液2 1 1 电极内液( m M ) ：K a s p a r t a t e1 1 0 ，K C I3 0 ，M g C l 21 ，H E P E S1 0 ，N a C l1 0 ，E G T A 0 0 5 ，p H 值用K O H 调至7 2 左右；两性霉素( a m p h o t e r i c i n B )在电极液中浓度为2 0 0 1 L g m l 。2 1 2 浴液( m
15、 M ) ：N a C l1 3 4 ，C a C l 2 1 8 ，M g C l 2l ，K C I6 ，g l u c o s e1 0 ，p H值用N a O H 调至7 4 左右。2 1 3 溶液I ( m M ) ：N a C l1 2 7 ，K C I5 9 ，C a C l 22 4 ，M g C l 21 2 ，g l u c o s e1 2 ，H E P E S1 0 ，p H 值用N a O H 调至7 4 左右。2 1 4 溶液( 砌旧：N a C I1 2 7 ，K C I5 9 ，M g C l 21 2 ，g l u c o s e1 2 ，H E P E S1
16、 0 ，p H 值用N a O H 调至7 4 左右。2 2 酶液配置酶I ( m g m 1 ) ：木瓜蛋白酶0 8 6 ，D T T1 5 ，自蛋白2 0 ，用溶液I I溶解于小瓶内。酶( m g w a ) ：胶原酶1 2 4 ，透明酯酸酶1 5 ，白蛋白1 5 ，用溶液溶解于小瓶内。2 3 试剂购置白蛋白，胶原酶，透明酯酸酶，木瓜蛋白酶，D T T ，K a s p a r t a t e ，H E P E S ，a m p h o t e d c i n - B ，u r i d i n e5 - t r i p h o s p h a t e ，c a f f e i n e ，r y a n o d i n e ，c h a r y b d o t o x i n 均购自S i g m a 公司，b i s i n d o l y m a l e i m i d e ( B i s I ) 购自C a
