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1、创性声明位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：衫静上D 留年葫日卜学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编
2、入中国学位论文全文数据库并向社会提供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社将本论文编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密d 。学位论躲召静厂 纠z 年6 月6 日指导教师签名：独l 涉V f a 卢卜一密级公珏 编号1 0 2 9 9 S 0 9 1 4 0 3 7江荨大擎学位论文内质网应激诱导剂预处理对丙烯腈毒性的保护作用及机制E n d o p l a s m i cR e t i c u l u mS t r e s sI n d u c e r sP r o t e c tA g a i n
3、 s tA c r y l o n i t r i l eT o x i c i t y ：T h eR o l eo fA u t o p h a g y指导教师陆苤挂教授姓名呈馥申请学位级别亟专业名称生理堂论文提交日期2 Q 1 2 生垒月论文答辩日期2 Q 1 2 生鱼月学位授予单位和日期江菱太堂2 Q 1 2 生鱼月评阅人2 0 1 2 年6 月基金资助：国家自然科学基金( 3 0 8 7 2 1 3 9 ) ；江苏省自然科学基金( B K 2 0 0 4 0 6 1 ) ；江苏省社会发展基金( B S 2 0 0 5 0 4 9 )2 D G ) 和氧化二硫苏糖醇( t r a n
4、s 一4 ，5 - d i h y d r o x y - 1 ，2 d i t h i a n e ，D T r o x ) 预处理对A N 毒性的保护作用及可能机制，特别是细胞自噬激活在内质网应激诱导的细胞保护中的作用。方法( 1 ) E R S 诱导剂对A N 损伤A S T 的保护作用及其机制：原代培养新生大鼠星形胶质细P 咆( a s t r o c y t e s ，A S T ) ，实验分两步：一，研究2 D G 和D T I b x 单纯处理大鼠A S T ，观察2 D G 和D T I o x 不同浓度及不同处理时间对A S T 的影响，特别是对内质网应激及细胞自噬的影响；二
5、，进行2 D G 和D I T o x 预处理，研究2 D G 和D T r o x 诱导内质网应激及细胞自噬等在A N 染毒A S T 中的保护作用。随机分为空白对照组、单纯A N 染毒组( 2 5m M 处理1 2h ) 、不同浓度的2 - D G ( 1m M 、5m M 、1 0r a M )分别预处理1 2 、2 4h 、不同浓度的D T I o x ( 1i n l V l 、5m M 、1 0m M ) 分别预处理1 、3h 。通过M r r r 比色法检测细胞活性；L D H ( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ) 漏9 5 率检测
6、细胞毒性；通过荧光素D C F - D A 探针采用荧光酶标仪检测细胞内活性氧( R O S ) 含量；采用J C 1 探针分析线粒体膜电位( 甲m ) ；蛋白印迹法确认内质网应激的标志性蛋白葡萄糖调节蛋白内质网应激诱导剂预处理对丙烯腈毒性的保护作用及机制7 8 ( G R P T 8 ) 、p - P E R K 和自噬的标志蛋白L C 3 、B e c l i n1 蛋白表达变化。( 2 ) 自噬抑制剂3 - M A ( 3 M e t h y l a m p h e t a I n i n e ) 预处理对2 - D G 和D T r o x 保护作用的影响：进行大鼠A S T 原代培养
7、，随机分为空白对照组、单纯A N 染毒组( 2 5m M 处理1 2h ) 、单纯3 - M A 处理组( 1 0m M 处理1 2h ) ，单纯2 - D G 处理组( 5m l V l 处理1 2h ) ，单纯D m x 处理组( 5m M处理3h ) ，3 - M A 预处理的2 - D G 诱导组( 5m M 浓度) 和D m x 诱导组( 5m M 浓度) 。通过M 兀比色法检测细胞活性。( 3 ) E R S 诱导剂对A N 染毒大鼠急性毒性的保护作用及其机制：在体染毒实验分两步：一，诱导剂最优剂量的选择2 8 只大鼠随机分为4组，分别给予5 0m g k g 、1 0 0m g
8、k g 和2 0 0m g k g 浓度的2 - D G ，同时设立生理盐水对照组，研究2 D G 的剂量效应关系，同时为下步实验选择合适剂量；二，诱导剂预处理对A N 氧化应激的影响3 6 只S D 大鼠随机分为6 组，三个浓度的2 - D G ( 5 0m g k g 、1 0 0m g k g 、2 0 0m g k g )处理组每1 2h 腹腔注射一次，持续一周，最后一次注射后8h 分别再给予5 0m g k g 、7 5m g k g A N ，染毒1h 后麻醉断头处死，同时设立生理盐水对照组及单纯A N ( 5 0m g k g 、7 5m g k g ) 组。蛋白印迹法( W e
9、 s t e r nB l o t ) 检测脑、肝脏组织内质网应激的标志性蛋白G R F 7 8 、P E R K 、p - P E R K 和自噬的标志蛋白L C 3 的表达以及氧化应激指标脂质过氧化产物丙二醛( M D A ) 、还原型谷胱甘肽( G S H ) 含量、超氧化物歧化酶( S O D )活性。结果( 1 ) E R S 诱导剂对A N 染毒A S T 的保护作用1 ) 与空白对照组相比，单纯A N 染毒组导致A S T 活性明显下降俨 O 0 5 ) i 而单纯2 - D G 组和单纯D 1 r o x 组预处理后，及2 - D G + A N 组和D T I b x + A
10、 N 组分别预处理不同时间后，M T r 法检测其细胞活性显著加组低多1 2h ) + A N 和D T r o x ( 5m M ，3h ) + A N 预处理组显著抑制A N 诱导的R O S 升高( P O 0 5 ) ，显著提高了线粒体膜电位( A r m ) 。4 ) W e s t e r nB l o t 结果显示2 - D G 和D 1 胁x 上调G R P 7 8 、P E R K 、B e c l i n l 蛋白的表达。p - P E R K 显著增加。诱导L C 3 活化，使L C3 I向L C 3 I I 转换。( 2 ) 自噬抑制剂3 - M A 预处理对2 - D
11、 G 和D 1 盼x 保护作用的影响与空白对照组相比，单纯A N 染毒组导致A S T 活性明显下降俨 O 0 5 ) ，而与E R S 诱导剂预处理+ A N 组比，自噬抑制剂3 - M A 预处理组显著抑制内质网应激诱导剂2 - D G 和D T r o x 诱导的保护作用( P O 0 5 ) 。( 3 ) E R S 诱导剂对A N 急性氧化毒性的保护作用及其机制1 ) 2 D G 最佳诱导剂量的选择：2 - D G ( 5 0 、1 0 0 、2 0 0m g k g ) 单纯处理后蛋白印迹法结果显示，与生理盐水组比，2 - D G ( 5 0 、1 0 0 、2 0 0m g k
12、g )处理组的脑、肝组织的G R P 7 8 蛋白表达水平升高，以a 0 0 m g k g 浓度组升高最显著。L C 3 蛋白表达结果显示2 - D G 诱导了L C 3 蛋白活化，使L C3 I 向L C 3 I I 转换。2 ) 2 D G 单纯处理组脑、肝组织的G R F 7 8 、P E R K 的蛋白表达显著增加，表明内质网应激的激活。内质网应激诱导剂预处理对丙烯腈毒性的保护作用及机制3 ) 与单纯A N 处理组( 5 0 、7 5m g k g ) L I , ，2 - D G 预处理组( 1 0 0m g k g )脑、肝组织的B e c l i n l 蛋白表达显著增加，以及
13、诱导了L C 3 活化，使L C3 I 向L C 3 I I 转换，表明内质网应激使细胞自噬被激活。4 ) 与对照组比，A N 组M D A 在脑组织和肝组织中显著增加( P O 0 5 ) ，A N 组G S H 含量在脑组织和肝组织显著减少( P O 0 5 ) ，脑、肝组织S O D 活性显著下降( P O 0 5 ) ，与A N 单纯组相比，2 D G + 5 0 A N 预处理组和2 D G + 7 5 A N 预处理组脑组织和肝组织M D A水平均降低，但以2 D G + 5 0 A N 预处理组M D A 水平降低最显著( P 0 0 5 ) 。与A N 单纯组相比，2 D G
14、+ 5 肿蝌预处理组和2 D G + 7 5 A N预处理组脑组织和肝组织的G S H 含量、S O D 活性均显著增 J N ( P 0 0 5 ) 。结论：内质网应激诱导剂能够显著提高A N 染毒星形胶质细胞的细胞活力，减少细胞毒性，抑制A N 诱导的R O S 生成。内质网应激诱导剂能够增强内质网应激标志蛋白G R P 7 8 、P E R K 表达，使P P E R K 蛋白磷酸化增加，表明适当的内质网应激可以保护细胞抵抗A N 的毒性。内质网应激诱导剂也使自噬应激的标志蛋白L C 3 活化和B e c l i n l 蛋白的表达增强，说明自噬激活可能是内质网应激诱导的保护机制。通过生
15、化指标M D A 、G S H 、S O D 的测定，2 D G 预处理能显著降低脑组织和肝组织M D A 水平，显著增加G S H 含量、S O D 活性，可以说明氧化应激被激活并对脑肝组织有保护效应。关键词：丙烯腈，内质网应激，2 - D G ；D T r o x ，预处理，自噬h a sb e e np a i dt oi t st o x i c i t y , e s p e c i a l l yn e u r o t o x i c i t y S t u d i e sh a v es h o w nt h a te n d o p l a s i m i cr e t i c
16、 u l u ms t r e s sC a l lp r o t e c ta g a i s tc h e m i c a ld a m a g eo fe n d o g e n o u sa n de x o g e n o u st ot h en e r v e s ，b r a i n ，l i v e r , k i d n e y , e t c T h i ss t u d yw a sd e s i g n e dt oe x p l o r et h ep r o t e c t i v ee f f e c t so ft h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s - i n d u c i n ga g e n t s ，2 - d e o x y dg l u c o s e ( 2
