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1、实验原理实验原理 DPPHDPPH 在有机溶剂中是一种稳定在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可见光区最大的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可见光区最大吸收峰为吸收峰为515515 nm17-20nm17-20，当，当DPPHDPPH 溶液中加入自由基溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱。因清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱。因此可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质此可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力。其作用原理如图的抗氧化能力。其作用原理如图1 1。图图1 DPPH 自由基清除作用原理自由基清除作用原理Fig. 1 Prin
2、ciple of DPPH free radical scavenging1.2.6 DPPHDPPH 自由基清除试验的测定方法自由基清除试验的测定方法 将每种将每种供试品溶液分别取供试品溶液分别取2020 LL 加样在加样在9696 孔板中，再在每孔板中，再在每个孔中平行加入个孔中平行加入180180 LL DPPHDPPH 溶液。同时设立对照溶液。同时设立对照组（等量乙醇代替供试液）组（等量乙醇代替供试液） ，空白组（，空白组（2020 LL 乙醇加乙醇加入入180180 LL DPPHDPPH 溶液）溶液） 。轻轻振荡，使充分混匀，。轻轻振荡，使充分混匀，将将9696 孔板放置在避光环境
3、下反应孔板放置在避光环境下反应3030 minmin。药物与。药物与自由基反应完全，在波长自由基反应完全，在波长515515 nmnm 处测定，记录最处测定，记录最终吸光度（终吸光度（A）值。）值。自由基清除率自由基清除率D= =（A 对照组对照组A 样品组）样品组）/ /（A 对照组对照组A 空白）空白）式中式中A 样品组为加入测试样品后反应液的吸光度；样品组为加入测试样品后反应液的吸光度；A 对照对照组组为对照组未加药的吸光度；为对照组未加药的吸光度；A 空白为空白组的吸光度。为空白为空白组的吸光度。为了减了减小实验误差，每样品设小实验误差，每样品设6 6 复孔，复孔，6 6 复孔取平均值
4、。复孔取平均值。DPPH(二苯代苦味酞自由基)在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其孤对电子在sl7nm附近有强吸收(显深紫色)。当有机清除剂存在时,孤对电子被配对,吸收消失或减弱,通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除剂的活性。DPPH法用以评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速(反应时间仅需20min左右)、简便、灵敏可行的方法。原理:DPPH(二苯带苦基麟基自由基)是一个大分子的稳定自由基抗氧化剂预期作用模式为:AH十DPPHDPPH一H十A依据DPPH具有单电子,在517nm处有一强吸收(深紫色),当自由基清除剂与其单电子配对使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系,因而可
5、用分光光度法进行定量分析91。抗氧化剂（物质） 测定波长515 nm（电离溶液）2.1.1 DPPH 标准曲线的绘制 分别吸取1、2、4、6、8、10 mL DPPH 对照贮备溶液，定量转移至10 mL棕色量瓶中，乙醇定容，摇匀。精密移取200 L 加入96 孔板中，515 nm 测其A 值。以质量浓度为横坐标，A 值为纵坐标，绘制标准曲线，每个质量浓度重复3 次，取平均值。得回归方程A10.88C0.075（r0.999 6） 。有机化合物的热氧化过程是一系列的自由基链式反应，在热、有机化合物的热氧化过程是一系列的自由基链式反应，在热、光或氧的作用下，有机分子的化学键发生断裂，生成活泼的自光
6、或氧的作用下，有机分子的化学键发生断裂，生成活泼的自由基和氢过氧化物。氢过氧化物发生分解反应，也生成烃氧自由基和氢过氧化物。氢过氧化物发生分解反应，也生成烃氧自由基和羟基自由基。这些自由基可以引发一系列的自由基链式由基和羟基自由基。这些自由基可以引发一系列的自由基链式反应，导致有机化合物的结构和性质发生根本变化。抗氧剂的反应，导致有机化合物的结构和性质发生根本变化。抗氧剂的作用是消除刚刚产生的自由基，或者促使氢过氧化物的分解，作用是消除刚刚产生的自由基，或者促使氢过氧化物的分解，阻止链式反应的进行。能消除自由基的抗氧剂有芳香胺和受阻阻止链式反应的进行。能消除自由基的抗氧剂有芳香胺和受阻酚等化合
7、物及其衍生物，称为主抗氧剂；能分解氢过氧化物的酚等化合物及其衍生物，称为主抗氧剂；能分解氢过氧化物的抗氧剂有含磷和含硫的有机化合物，称为辅助抗氧剂。抗氧剂有含磷和含硫的有机化合物，称为辅助抗氧剂。一胡萝卜素是一种多烯色素,易被氧化 而褪去黄色。在反应介质溶液中,由亚油酸氧 化产生的过氧化物等能使 p 一胡萝卜素漂白, 随时间的延长吸光度越来越小。当以吸光度对 时间作图时可得到一条下降曲线。不同原料的 溶剂提取物,按其抗氧化活性的大小不同而使 p 一胡萝卜素漂白的速度各异。抗氧化能力越 强,吸光度下降越慢。因而不同的曲线有不同 的斜率。抗氧化能力越强的,曲线斜率绝对值 越小。 邻苯三酚自氧化法
8、邻苯三酚在碱性条件下会自动氧化,不断 释放出价,价又会进一步促进自氧化过程, 生成有色中间产物,先生成的中间产物又不断 被氧化成其他中间物,由此邻苯三酚在自氧化 过程中出现一系列的颜色变化。在邻苯三酚的 自氧化初期,中间物的积累浓度(或吸光度) 在反应开始 30 一 455 后与时间呈线性关系,一般 线性时间维持 4min 左右。因此通过测定不同时 刻自氧化中间产物的吸光度,并对时间作图, 可求得邻苯三酚的自氧化速率,当向体系中加 入抗氧化活性物质时,同样可求得。戈的抑制率 I,41。氮蓝四哇(NBT)法 o 气可使 NBT 还原成蓝色的化合物,其最 大吸收波长为 560nln,吸光系数达 1
9、0000 以上, 测定灵敏度相当高。同时,o 入在 H 十作用下会 被歧化成 HZOZ。在反应体系中若没有抗氧化活 性物质存在,则。灰的歧化反应很慢,有抗氧 化活性物质就会加速歧化反应,因而蓝色化合 物的生成量就会减少,所以通过反应体系的吸 光度随时间的变化可以测定蔬菜的抗氧化活 性,5。 氧自由基吸收能力(ORAC)分析法 p 一藻红素(p 一 E)在 540 刊 m 光波激发下, 可发射 565nm 的荧光,AAPH 在水溶液中可释 放过氧自由基,并将 p 一 E 氧化,使其荧光特征 消失。当抗氧化剂存在时可与卜 PE 竞争氧化 剂,减缓 p 一 E 荧光消失的速度。根据这一特征, 可测定
10、氧自由基的清除活性 l8。 C 改良的 ABTs+法 对测定抗氧化活性的 ABTS 十法进行改良, 以提高分析速度、降低分析成本,并将该方法用 于水果中抗氧化活性物质提取条件的优化。该 方法即在酶标板上以 Trolox 为标准对照,测定 抗氧化物质对预先制备的自由基 ABTS+的清 除能力。用不同浓度的乙醇和重亚硫酸钠为提 取液,在不同的温度和溶剂 P 水果比条件下,提 取水果 blackc 叮 ant 中的抗氧化活性物质,寻找 从单位重量水果中提取抗氧化活性水平较高 的条件 118。 铁离子还原/抗氧化力 FRAP(fetric reducing/antioxidantPowerassay)
11、法原理为 Fe3+一三毗陡三叮嗦(triPyridyl 一 triazine,TPTZ, sigma)可被样品中还原物质还原为二价铁形 式,呈现出蓝色,并于 593lun 处具有最大光吸 收,根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强 弱19 一。 1.2.4.4TEAC 法 Mi!eretal.了 1993)首次报道了 TEAC 法,并在后来加以改进,改进的方法中氧化齐日 ABTS 一是 由过硫酸氧化 ABTsZ 一产生的“7mmolABTS 铰盐溶于水后,加 2.45mmof 的过硫酸钾,混合 液放置12 一 16h 后得到深蓝色溶液“用乙醇或缓冲液(州 7.4)稀释到 734nm 处吸光度为
12、0.7“取 lml 最终 的溶液,加 1oul 样品,30OC 保温,混合后的 1!4!6min 测定吸光值“以抗氧化剂浓度和吸光值分 别 为横纵坐标作曲线,获得与 lmMTrolox 具有同样吸光读数的抗氧化剂浓度为 TEAC 值“由于 操作简 便,TEAC 被实验室广泛用于测定抗氧化剂的活性“(l)“超氧阴离子超氧阴离子,一清除能力测定一清除能力测定超氧阴离子自由基是生物体内主要的自由基“它是基态氧接受一个电子后形成的第一个氧自 由 基,可以经过一系列反应生成其他的氧自由基,引起脂质过氧化导致细胞膜结构和功能的改变, 导 致细胞膜流动性下降及膜蛋白产生交联“它的测定方法已有一些报道,主要有
13、电子自旋共振! 比色 法!化学发光法!电化学法和生物传感器法“(2)H202:清除能力测定清除能力测定在低浓度下 HZO:活性很低,一般认为在生理条件下,HZO:是与 Fe(ll)结合后产生氧化能力“在 生物体内,H20:由过氧化氢酶催化产生氧气和水“最常见的测定膳食抗氧化剂清除 HZO:的方 法中为 使用 horseradish 过氧化物酶来氧化蓑著亭,使之成为无荧光化合物“抗氧化剂存在时,氧化反 应被 抑制“抗氧化剂通过以下方式抑制氧化反应:与 H20:直接反应; 与酶和 HZO:的中间产物反 应; 抑制 horseradish 过氧化物酶与 HZO:结合“(3)HO.清除能力测定清除能力
14、测定生物学上一致认为过氧化氢与 Fe(II)反应(Fenton 反应)产生 HO,但是 Fe(II)/H20:混合物却 不能用于测定抗氧化剂清除 Ho.的能力,因为许多抗氧化剂同时也是金属鳌合剂,当样品与 Fe(JI)混 合后,会通过鳌合来降低铁的活性,结果就不能分辨是由鳌合铁离子引起的还是清除自由基造 成的(4)单线态氧单线态氧(.02)清除清除光及光敏剂存在时常产生单线态氧,一般也认为单线态氧导致与紫外线有光的皮肤伤害丈 Sieset al.,2004),眼睛晶状体的白内障(zigma;1.2000),面部黄斑的发生(Rozanowska.!998)“没有光线 时,生物体内几乎不产生单线态
15、氧“超氧阴离子在细胞外的自发性歧化反应可有一定的生理 意义(Ta 二 etal.,2003)“另外,金属或次氯酸盐一叮以使过氧化氢降解产生单线态氧,而不需要发生光反应(Marti,1 倪 etal.,2000:Aub 卿 etal.,1985;Busbyetal.,一 999)“通过将激发能量转移到其它分子 (被激 发)或者传给抗氧化剂以形成内过氧化物这些物理方法,单线态氧可被清除“B 一胡萝卜素具 有清除 单线态氧能力“单线态氧在 1270nm 处发射特征磷光“光强衰变可用来测定化合物清除单线 态氧的能 力“Fueta.(997)报道了一种非常灵敏的方法,用来检测清除四叔丁基酞氰(sDSDF
16、)被单线态 氧 敏化(703nm)的迟发型荧光“在 703nm 下测定 SDSDF 可以使测定方法在普通仪器上进行,因 此有 可能作为一种灵敏的方法用于测定清除单线态氧的清除,而 1270 二处磷光很难检测“但这种 方法还 没有被广泛的使用“(5)过氧亚硝酸基过氧亚硝酸基(ONOO.一一)清除清除超氧化物与一氧化氮以扩散控制速度形成过氧亚硝酸基(Moncadaetal.,1995)“q 一(E“一 0.33V)和 NO(E 性 0.39v)非强氧化剂,加成物 ONOO.一也不是强氧化剂“但其质子化了的产 物, 过氧亚硝酸(oN00H)是非常强的氧化剂(E0 三 2.10v)“在生理 pH 条件下,过氧亚硝酸会形成氧 化 能力较低的硝酸盐(81)“在 pH7.4 时,过氧亚硝酸基与过氧亚硝酸的比例为 4:1,它们常引起芳 香 化合物硝化和轻基化,尤其使酪氨酸形成硝基酪氨酸#在生理条件下,过氧亚硝基还与溶
