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1、海峡两岸中医药发展大会C r o s s - S t r a i tC o n f c r c n c co nt h eD e v e l o p m e n to fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n eR N A 干扰与H I V 感染马琰岩刘红吕俊海牛晓红通讯作者：杨鸿中国中医科学院医学实验中心北京1 0 0 7 0 0艾滋病是一种灾难性和全球性流行病，已给世界各国人民身体健康、生命安全带来了严重威胁。据W H 0 2 0 0 3年报到，全球已有6 0 0 0 万H I V 病毒携带者，且以1 4 0 0 0 人，天的速度递增
2、。令人不安的是虽然世界各国投入了大量人力物力对其进行研究，治疗H I V 的各种药物正不断地发展，出现了一些新的药物；同时也出现了一些新的治疗思路，先后建立了反义R N A ，R I g A 捕获等【l 】技术手段，但大多是主要针对蛋白酶及转录水平上的一些药物治疗，对H I V 至今仍无有效的根治办法此外H I V 变异快，受感染情况更为复杂，抗药性的出现以及药物治疗的副作用都要求人们寻找新的反病毒措施。近来R N A 干扰( R N Ai n t e r f e r e n c e ) 研究技术的出现，似乎为解决H I V的抑制及治疗提供了一种新的尝试，带来了一线曙光。本文拟就其可能机制及其
3、在抗H I V 感染方面的应用做一简介。一、R N A 干扰现象R N A 干扰( R N Ai n t e r f e r e n c e ) 效应是一种特异的转录后基因沉寂现象( p o s tt r a n s -e r i p t i o nG - e n es i l e n c i n g ，F I G S ) 。1 9 9 0 年，J o r g o n a s o n 小组进行转基因植物研究时偶然发现，将全长或部分基因导入植物细胞后，某些内源性基因不能表达，但这些基因的转录并未受任何影响，这种现象称为共抑制( s u p p r e s s i o n ) 也叫正义抑制( s
4、e n s es u p p r e s s i o n ) ，属于转录后基因沉默( p o s t - w a n s c d p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，P T G S )脚。1 9 9 6 年，意大利科学家M a c i n o 和C o g o n i 等在真菌粗糙孢霉属( N e u r o s p o r a ) 中发现了相似现象，他们将之称为基因压制( q u e u i n g ) 3 1 。1 9 9 8 年，F i r e 等在研究秀丽新小杆线虫基因表达调控时发现，由正链和负链退火形成的双链R N A 能特异的引起与其同源的
5、基因产生表达抑制。并将这种现象命名为R N A 干扰( R N A i n t e r f e r e n e e ) 此后，陆续发现R N A 干扰现象存在于真菌、水稻、烟草，拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、水蛭、果蝇、斑马鱼、爪蟾以及小鼠( 早期胚胎) 等几乎所有真核生物中【1 3 】。这些研究成果表明：R N A 干扰机制很可能在进化初期就产生了，是存在于生物体中的一种古老的防御机制。其作为一个R N A 依赖的基因沉默机制，同免疫系统一样，它的自然功能是保护基因组免遭外来基因的攻击。在转座子封闭、细胞分化及抗病毒感染等方面发挥着极为重要的生物学功能。现在R N A 干扰技术已逐渐取代基因敲除
6、技术( k n o c ko u t ) ，广泛应用于功能基因组、信号传导、基因治疗等方面的研究工作，并成为一种强有力的研究手段。在大多数系统中，R N A i 比反义R N A 更有意义，但机制上与反义R N A 明显不同。= 、R N A 的作用机制R N A 干扰现象的最终结果是使转录的活性基因沉默，这种转录的沉默首先是由小的干扰性R N A 片段( s m a l li n t e r f e r e n c eR N A ，s i R N A ) 引起的。s i R N A 是一类大约为2 1 2 3 b p 核苷酸的特殊双链R N A ，具有特征性结构，即这种双链小R N A 的序
7、列与所作用的靶m R N A ，序列具有同源性u 4 1 ，其特征表现为s i R N A 两条单链末端的5 端磷酸和3 ，端羟基。此外，每条单链3 端均有2 - 3 个突出的非配对的残基。现已初步阐明R N A 的干扰机制1 1 5 ，首先，双链R N A 由内切核酸酶( 一种具有R N A 酶m 活性的核酸酶) 作用下被切割成2 1 - 2 3 的干扰性s i R N A ：然后由s i R N A 中的反义链指导形成一种核蛋白体，该核蛋白体称为R N A 诱导的沉默复合体( R N A - i n d u c c dS i l e n c i n gc o m p l e x ，R I
8、S C ) ，由R I S C 介导切割靶m R N A ，分子中与s i R N A 反义链互补的区域，从而达到干扰基因表达的作用s i R N A 可作为一种特殊引物，在R N A 依赖的R N A 聚合酶( R N A - d i r e c t e dR N Ap o l y m c r a s e ，R d R P ) 的作用下，以靶m R N A ，为模板合成d s R N A ，后者可被降解形成新的s i R N A ，又进入上述循环，该过程称为随机降解性多聚酶链式反应( r a n d o md e g r a d a t i v eP C R ) ；新生成的d s R N A
9、 反复合成和降解，不断产生新的s i R N A ，从而使靶m R N A 渐进性减少，呈现基因沉默现象n 6 1 ，因此，每个细胞只需要少量的d s R N A ，即能完全关闭相应基因表2 7 6海峡两岸中医药发展大会C r o s s S t r a i tC o n f e r e n c eo l lt h eD e v e l o p m e n to f T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e达，可见R N A i 过程具有生物催化反应的基本动力学特征。三、R N A 干扰的特点1 特异性R N A 干扰的显著特点是其特异
10、性。小干扰R N A 只抑制其同源的m R N A ，有极高的序列特异性，而对非同源序列却没有影响，即使一个碱基的错配也会显著降低其抑制效应。Ja e q u eJ N I t 四】等分别设计了0 ，1 ，4 b p 与靶m R N A 不配对的小干扰R N A ，转染细胞后发现完全配对的小干扰R N A 抑制效率极高，4 b p 不配对的小干扰R N A 没有抑制效应产生。l b p 不配对的小干扰R N A 只能产生微弱的抑制效应。2 高校性R N A 干扰的另特点是其高效性研究表明，仅几个小干扰R N A 便可以抑制浓度是其几倍，几十倍的m R N A 的表达。其可能机制一是小干扰R N
11、 A 反复参加m R N A 降解，= 是小干扰R N A 可在细胞中通过R N A 依赖的R N A 酶R d R p ( R N Ad e p e n d e n tR N A 叫y m e r - a s e ) 途径放大其效应四、小干扰R N A 的来源及进展( 一) 小干扰R N A 的来源小干扰R N A 在R N A 干扰研究中起着核心作用目前其来源主要有以下两种：1 人工合成法1 1 7 在体外根据靶R N A 的序列，设计并合成大量的小干扰R H A ，然后转染细胞。这种方法存在转染效率不高，R N A 稳定性不够，易降解等问题。另外，H i r o a k i 【l 町等人
12、工构建了重组人D i c e r ( r e c o m b i n a n th u m a nD i c e r ) ，在体外亦能产生大量的小干扰R N A 2 体内表达法通过人工构建的载体，在体内表达小干扰R N A 已发展成为一项相当成熟的技术。这些小干扰R N A 有两种表达方式：第一，载体中有两个启动子分别转录小干扰R N A 的正链和负链，然后在体内退火成双链小干扰R N A 。第二，载体中的R N A p o l l l l 启动子转录出的R N A 自发折叠成发夹结构，称之为短的发夹R N A( s h o r th a i r p i nR N A ，s h R N A )
13、 s h R N A 最终将激活内源的R I S C 介导的R N A 干扰，从而封闭靶基因的表达。( 二) 小干扰R N A 研究的进展比较以上两种小干扰R N A 产生的方法可以发现，体内表达法可以长期稳定的表达小干扰R N A ，且克服了人工合成法中转染效率不高的难题，在R N A 干扰研究中得到了广泛应用。D a n i e lB o d e n 9 等还对小干扰R N A 启动子偏好性作了研究。通过比较T 7 启动子和M T D ( m o d i f i e dt R N A m e td e r i v e d ) 启动子H 1 ，U 6 + l ，U 6+ 2 7 表达小干扰R
14、 N A 的量，发现M T D 启动子的表达效率较T 7 启动子高2 0 以上1 e s e p hA n d e r s o n 1 】等对小发夹R N A 的环的序列作了研究，发现U U C A A G A G A 序列较容易形成小发夹R N A ，因而其抑制效率较高。用于R N A 干扰研究的载体有质粒载体和病毒载体病毒载体有转染效率高的优点较为常用，如慢病毒载体【l 加l和逆转录载体【1 1 1 逆转录载体被认为是最有希望的载体。其主要优点有：基因转移效率高，宿主范围广五、R N A 在抗m v 1 摩染上的作用H I V 分H I V - 1 和I - I I V - 2 两型，西方
15、以H 1 V 1 为主，中国1 9 9 9 年报道以H I V - 1 和H I V 2 混合型感染居多。H I V 的生活周期可分为附着细胞，复制，基因表达和成熟4 个阶段。H I V 感染细胞后，含有基因组病毒R N A 的核蛋白转录复合体进入胞浆，称为新生病毒基因组，此阶段为病毒复制的早期阶段，由于病毒尚未大量复制，此阶段也是R N A i 抑制病毒的最佳时期。经逆转录，形成病毒e D N A 后进入胞核，整合入细胞基因组形成原病毒( p r o v i r u s ) 在病毒编码的蛋白T 缸的作用下，原病毒产生病毒的R N A 转录本，之后在病毒蛋白R e v 和辅助因子C R M l
16、 的辅助下R N A 转录本输出核，其中部分转录本作为m R N A 翻译合成病毒的结构蛋白，如e n V 蛋白部分R N A 转录本作为病毒基因组R N A ，装配成新生病毒体此阶段为病毒复制的晚期阶段。由此可见，H W 基因组结构极为复杂，除了具有逆转录病毒共有的e n V ，g a g ，p o l 三个结构基因外，H I V 还有t a t ，形v ，n e f 等调节基因和v i i ，v p r 等辅助调节基因各个基因在H I V 生活史的不同时期表达，发挥不同的功能。在其感染的各个阶段分别表达在此阶段具有关键作用的病毒蛋白，这些蛋白都已成为H I V 小干扰R N A 设计的靶标。以H I V 1为例，有9 个基因。目前应用R N A i 治疗H I V 1 感染主要集中于新生病毒基因组( i n c o m i n gv i r a lg e n o m e s ) 及n e f 、t a t 、r c v 、c n v 等4 个基因。( 一) 针对H I V - 1 本身的枷l N
