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1、实验 植物细胞的质壁分离及死活鉴定死细胞和活细胞原生质的理化性质存在差别，如活细胞原生质的膜系统具有半透性，可与外界溶液构成渗透系统；活细胞可以主动积累某些溶质等，而死细胞的原生质则丧失了这些特征。在植物生理学研究中，经常需要鉴定细胞的死活。本实验介绍两种鉴定方法：活体染色法及质壁分离法，还可以通过对活体染色及质壁分离结果的观察，了解原生质的某些特性，如粘滞性、荷电性等，以加深对理论的理解。一、植物细胞的活体染色与死活鉴定【原理】活体染色是利用某种对植物无害的染料溶液对活细胞进行染色的技术。中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围在 pH6.48.0 之间(由红变黄)
2、。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应。因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内。因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。【仪器与用具】显微镜；小培养皿；载玻片；盖玻片；单面刀片；尖头镊子；酒精灯；火柴；擦镜纸；吸水纸适量。【试剂】0.03%中性红溶液；1mol/L 硝酸钾溶液。【方法】1.选用洋葱鳞茎（或大葱假茎基部）及小麦叶片作材料。2.切下一
3、片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成 0.5cm2左右的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内侧向下） 。若用小麦叶片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片上，再将此载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀片从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到只剩下少量叶肉细胞时要十分小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除小麦外其他禾本科植物也可用此法制备表皮细胞，将刮好的材料切成约 0.5cm2小块。3.将制好的洋葱鳞茎内表皮或小麦叶片上表皮小块投入 0.0
4、3%的中性红溶液中染色510min，取出 12 片，在蒸馏水中稍加冲洗，在载玻片上滴一滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察，可看到细胞壁被染成红色，而原生质和液泡均不染色，这是因为蒸馏水偏酸，在弱酸性条件下细胞壁带负电荷和染料阳离子发生吸附的结果。4.将步骤 3 中的活体染色制片取出几片放入 pH 略高于 7.0 的自来水中浸泡1015min，再置于载玻片上镜检，将发现细胞壁脱色，而液泡却被染成深红色，这是因为在溶液 pH 高于 7.0 的情况下，中性红分子的解离作用很弱，主要以分子状态存在，不易被细胞壁吸附，但较易透过质膜和液泡膜进入液泡，而植物的细胞液多呈酸性反应
5、，进入液泡的中性红于是发生解离，将液泡染成樱桃红色。此时细胞核和原生质不染色。为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入 1mol/L 的硝酸钾溶液中浸泡10min 左右，然后取出观察。由于硝酸钾能使原生质强烈膨胀，发生“帽状质壁分离” ，因而能清楚地区别开无色透明的原生质和染成红色的液泡。5.将步骤 4 中的活体制片放在酒精灯火焰上微微加热，以杀死细胞，再在显微镜下观察，会看到原生质凝结成不均匀的凝胶状，与细胞核一起被染成红色。6.在活体染色制片中仔细寻找，可能看到个别死细胞，其细胞核因被中性红染色而呈红色，清晰可辨。二、植物细胞的质壁分离与质壁分离复原【原理】生长的植物细胞是一个渗
6、透系统，活细胞的原生质及其表层具有分别透性，原生质层内部含有一个大液泡，具有一定的溶质势。当细胞与外界高渗溶液接触时，细胞内的水分外渗，原生质随着液泡一起收缩而发生质壁分离，其后，当与清水（或低渗溶液）接触，或当外面的溶质进入时，具有液泡的原生质体就又吸水而发生质壁分离复原。【仪器与用具】见本实验项目一。【试剂】0.03%中性红溶液；1mol/L 硝酸钾溶液；4mol/L（24%）尿素溶液。【方法】1.取洋葱鳞片或小麦叶片按本实验项目一中的方法进行制片和活体染色。2.将染好色的制片放在载玻片上，盖好盖玻片，在显微镜下观察，可以看出明显的液泡染色，无色透明的原生质层则紧贴细胞壁（在细胞的角隅上可
7、以看见） 。3.从盖玻片的一边滴一滴 1mol/L 硝酸钾溶液而在对边用滤纸吸水，将硝酸钾溶液引入盖玻片下使与制片接触并立即镜检，可看到细胞内很快发生凸形质壁分离。4.观察到质壁分离后，于盖玻片一边小心加清水一滴，于对边用滤纸缓缓吸去硝酸钾溶液，重复二次，使质壁分离剂（即高渗的硝酸钾溶液）被基本上洗吸掉。镜检，可看到质壁分离停止进行，相反，带有液泡的原生质体开始重新吸水膨大，最后又充满整个细胞腔，这就是质壁分离复原现象。质壁分离复原缓缓进行时，细胞仍会正常存活；如进行很快，则原生质体会发生机械破坏而死亡。5.撕取蚕豆（或其他植物）叶片下表皮置于载玻片上，滴加 4mol/L（24）尿素溶液后立即盖上盖玻片并进行镜检。首先见表皮细胞及保卫细胞同时发生质壁分离，约1015min 后保卫细胞开始发生质壁分离复原，由于保卫细胞经长时间的充分紧张，气孔大开，而其他表皮细胞长时间（甚至几小时）后才开始发生质壁分离复原，可见不同功能的细胞对物质有不同的透性。6.另取一部分制片置载玻片上，先在酒精灯上加热，以杀死细胞，再引入高渗硝酸钾溶液，观察有无质壁分离发生。
