血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

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1、实验一实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳一、目的一、目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。二、原理二、原理带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳：采用醋酸纤维 薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维薄膜电泳法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成， 它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅 12m，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电 泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附 现象等优点。目前已广泛用于血清蛋由、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同功酶的分离及用 在免疫电泳中。三、器材三、器材1醋酸纤维薄膜（28c

2、m） 2常压电泳仪 3点样器 4培养皿 5粗滤纸 6玻璃板 7竹镊 8白磁反应板 9新鲜血清四、试剂四、试剂1巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度 0.07） 巴比妥 2.67g，巴比妥钠 15.45g，加水至 1000m1。 2染色液 含氨基黑 10B 0.25g，甲醇 50ml，冰醋酸 10ml，水 40m1。 可反复使用。 3漂洗液 含甲醇或乙醇 45 m1，冰醋酸 5ml，水 50m1。 4透明液 含无水乙醇 7 份，冰醋酸 3 份。五、操作五、操作1浸泡： 用镊子取醋酸纤维薄膜一张（识别光泽面与元光溶面，并在一角做上记号） ，放在缓冲 液中浸泡 20min。 2点样： 把膜条从缓冲液中

3、取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后将无光泽重面朝上平铺 在玻璃扳上。将点样器放置于白磁反应板中的血清中沾一下，再在膜一端 1.5cm 处轻轻地 水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上细条状的血清样品。掌握点样技术，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。 3电泳： 如图 1.在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽的液面等高，将膜条无光泽面向下平悬于电 泳槽支架的滤纸桥上（滤纸桥是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的桥梁） 。膜条上点样 一端靠近负极。盖严电泳室，通电，调节电压 90100V，电流强度 0.40.7mA/cm2，通 电 4560min，待电泳区带展开 2.53cm 时，关闭

4、电源。染色： 电泳完毕后，将膜条取下放在染色液中浸泡 10min。 5漂洗： 将膜条从染色液中取出后，在漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带 清晰的电泳图谱。从正极端起，依次为：清蛋白、1蛋白、2球蛋白。 蛋白、 球蛋白。 如图 2 所示：定量测定时，可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪下，分别浸在 0.4N NaOH 溶 液中，并剪下相同大小的无色区带，膜条作空白对照，迸行比色；或者将干燥的电泳图谱 膜条放入透明液中浸泡 23min 后贴于洁净玻璃板上，干后，即为透明的薄膜图谱，可用 光密度计直接测定。实验二实验二 酪蛋白的制备酪蛋白的制备一、目的一、目的学习从牛乳中制备酪蛋白的

5、原理和方法。二、原理二、原理牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物， 等电点为 4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的 pH 调至 4.7 时，酶蛋白就沉淀 出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后，便可得到纯的酪蛋白。三、器材三、器材1牛奶 2离心机 3抽滤装置 4精密 pH 试纸或酸度计 5电炉 6烧杯 7温度计四、试剂四、试剂195%乙醇 2无水乙醚 3. 0.2MpH4.7 醋酸-醋酸钠缓冲液 A 液：0.2M 醋酸钠溶液 B 液：0.2M 醋酸溶液 称有机纯醋酸（含量大于 99.8%）12.0g,定容至 1000ml 4.去 A 液 1

6、770ml,B 液 1230ml 混匀，即得 pH4.7 醋酸-醋酸钠缓冲液。 5.乙醇乙醚混合溶液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）五、操作五、操作1.将 100 牛奶加热到 4。边搅拌边缓缓加入预热至 40的缓冲液，并调节 pH 之后， 冷却至室温。以 3000r/min 离心 10min。弃去上清液，得酪蛋白粗制品。 2.用水洗涤三次，3000r/min 离心，弃去上清液。 3.在沉淀中加入乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚 混合液沉淀两次，最后再用乙醚沉淀两次，抽干。 4.将沉淀摊开在表面皿上，干燥后得酪蛋白纯品。 5.准确称量后，计算含量，并与理论含量（3.5

7、g/100ml）相比求出实际得率。酪蛋白 含量 g/100ml：牛乳(g%)得率=100%理论含量测得含量实验三实验三 甲醛滴定法测氨基氮甲醛滴定法测氨基氮一、目的一、目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。二、原理二、原理水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨 基酸，甲醛与氨基结合，可形成NHCH20H，N(CH20H)2等羟甲基衍生物，使 NH3+放 出的 H游离出来，这样就可用碱滴定放出的 H，测定氨基氮，从而计算出氨基酸的含量。若样品中只含某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果可算出氨基酸的量。若样品是多 种氨基酸的混合物如蛋白水解液 ，则

8、滴定结果不能作氨基酸滴定量的依据。一般常用此 法测定蛋由质水解程度，水解程度的增加滴定值增大，当水解完全后，滴定值保持平衡。 但脯氨酸与甲醛作用生成不稳定化合物，致使滴定结果偏低；脯氨酸的酚基结构又可使滴 定结果偏高。三、器材三、器材1、锥形瓶 2、25 ml 碱式滴定管 3、移液管四、试剂四、试剂10.5%酚酞酒精溶液0.5g 酚酞溶于 100mL60%乙醇中 20.05%溴麝香草酚蓝溶液0.05g 溴麝香草酚蓝溶于 100mL20%乙醇溶液中 31甘氨酸溶液 1g 甘氨酸溶于 100rnl 蒸馏水 4标准 0.100mol/LNaOH 溶液，可采用 0.100mol/L 标准 HCl 溶液

9、标定5中性甲醛溶液 50ml 甲醛溶液，加约 3ml0.5%酚酞指示剂，滴加 o.1mol/LNaOH 溶液，使溶液成微粉 红色，临用前配制。五、操作五、操作取 3 只锥形瓶，编以 1、2、3 号。于 1、2 号瓶中各加甘氨酸溶液 2.0ml 及水 5.0ml； 于 3 号瓶中加水 7.0ml。然后 3 只锥形瓶中各加入甲醛溶液 5.0ml,0.05%溴麝香草酚蓝溶 液两滴及 0.5%酚酞酒精溶液 4 滴。再用标准 0.1mol/LNaOH 溶液，滴定至紫色(pH0.7-9.0)。 则每 ml 氨基酸溶液中含氨基氮的 mg 数为：氨基氮（mg/ml）=24008. 1)( BA注：A滴定样品消

10、耗 NaOH 溶液的 ml 数B滴定空白消耗 NaOH 溶液的 ml 数 1.40081ml0.1mol/LNaOH 溶液相当的氮 mg实验四实验四 氨基酸纸层析法氨基酸纸层析法一、目的一、目的通过氨基酸的分离，了解层析法的基本原理和操作方法。二、原理二、原理用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用展层溶剂大多由水和有 机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固 定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的称上行法；由上向下移动的称下行法。将 样品点在滤纸上（此点称原点） ，进行展层，样品中氨基酸在两相中不断迸行分配。由于它 们的分配系数不同，不

11、同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是将氨基酸分离开来。形 成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用 Rf值表示：Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 在一定条件下，某种物质的 Rf值是常数。 本实验采用纸层析法分离氨基酸。氨基酸是无色的，利用茚三酮反应，可将氨基酸层 析点显色作定性、定量用。三、器材三、器材1氨基酸溶液：缬氨酸、组氨酸、亮氨酸和谷氨酸溶液及它们的混合液，各组分浓度均为 0.5。 2层析缸 3层析滤纸（新华 1 号） 4毛细管 5吹风机 6烘箱 7喷雾器 8刻度尺 9铅笔 10表面皿四、试剂四、试剂1展层剂： 正丁醇：甲酸：

12、水15：3：2（VV） 2显色剂：0.5g 茚三酮溶于 100ml 无水丙酮，即得 0.5茚三酮一无水丙酮溶液，贮于棕色瓶中 备用。五、操作五、操作1标记： 取层析滤纸（2214cm）一张。在纸的一端距边缘 23cm 处用铅笔划一直线，在直 线上每间隔 2cm 做一记号，标出 5 个原点。 2点样： 用毛细管将各氨基酸样品点在 5 个原点上，用量 1020l，点子直径不超过 3mm,边 点样边用电吹风吹干。 3展层： 将点好样滤纸放入装于展层剂的层析缸内，展层剂必须在点于下方。盖层析缸。待溶 剂上升至 1520cm，用铅笔描出溶剂前沿界线，把滤纸放于表面皿上，于烘箱内 105 15min 烘干

13、。 4显色： 用喷雾器均匀喷上显色剂后于烘箱内 1005min，即可显出个层析斑点。 5计算各种氨基酸的 Rf值。实验五实验五 酵母核糖核酸的提取及组分鉴定酵母核糖核酸的提取及组分鉴定一、目的一、目的了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。二、原理二、原理酵母核酸中 RNA 含量较多，DNA 少于 2%。RNA 可溶于碱性溶液，当碱被中和后， 加入乙醇可使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到 RNA 粗制品。三、器材三、器材1干酵母粉 2天平 3烧杯 4抽滤瓶 5布氏漏斗 6移液管 7玻棒 8pH 试纸 9离心机四、试剂四、试剂10.2%NaOH 溶液 2乙酸（A.R） 395%乙醇 4无水乙醚（

14、C.P） 5氨水（C.P） 610H2SO4溶液 75AgNO3溶液： 5g AgNO3溶于蒸馏水，定容至 l00ml，贮于棕色瓶中。 8苔黑酚一三氯化铁试剂 9定磷试剂五、操作五、操作RNA 的提取 称取g 干酵母粉于 100ml 烧杯中，加入 0.2%NaOH 溶液 40ml，沸水浴中加热 30min 并经常搅拌。加数滴乙酸，使提取液呈酸性。4000r/min 离心 1015min ，取上清夜，边 搅边搅拌边加入 95%乙醇洗涤两次，无水乙醚洗两次后，将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤， 干燥后即得粗 RNA。 鉴定： 取上述粗 RNA0.5g，加 10%H2SO4溶液 5ml，加热至沸 12mi

15、n，制得 RNA 水解液。 （）嘌呤碱： 取水解液 2ml，加氨水 2ml，5NaOH 溶液，观察是否产生絮状嘌呤碱的银化合物。 （）核糖： 取水解液 0.ml，加苔黑酚-FeCI3；试剂 1ml，加热至沸 1min，观察颜色变化。 （）磷酸： 取水解液 1ml，加定磷试剂 1ml，水浴上加热，观察溶液是否变成蓝色。实验六实验六 蒽酮比色定糖法蒽酮比色定糖法一、目的一、目的掌握蒽酮比色定糖法的原理及方法。二、原理二、原理蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己醛糖酸起反应，反应后溶液呈 蓝绿色，在 620nm 处有最大吸收。蒽酮可与其它一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。 当样品中存在

16、有含较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。本法是一种快速而简 便的定糖方法，多用于测定糖原含量，亦可用于测定可溶性糖含量。三、器材三、器材l移液管 2刻度试管 3水浴锅 4冰浴锅 572 型分光光度计四、试剂四、试剂1无蛋白糖类溶液： 2蒽酮试剂 2g 蒽酮溶于 1000ml80%(v/v)硫酸中，现配现用。 3标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） 100mg 糖原溶于蒸馏水定容至 1000ml。五、操作五、操作1制作标准曲线 取 6 支试管编号，依次加入标准糖溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，均用蒸馏水 补足至 l.0ml。置水浴中 5min，各加蒽酮试剂 4ml，沸水浴中准确煮沸 10min，自来水冷却， 室温放置 10min 后，比色测定光密度 OD620，并以此为纵