《1人巨噬细胞金属弹性蛋白酶在胃癌细胞及胃癌组织中的表达及临床意义2胃癌和结肠癌患者二氢嘧啶脱氢酶基因多态性与5FU代谢及临床意义探索》由会员分享，可在线阅读，更多相关《1人巨噬细胞金属弹性蛋白酶在胃癌细胞及胃癌组织中的表达及临床意义2胃癌和结肠癌患者二氢嘧啶脱氢酶基因多态性与5FU代谢及临床意义探索（104页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学博士学位论文1.人巨噬细胞金属弹性蛋白酶在胃癌细胞及胃癌组织中的表达 及临床意义;2.胃癌和结肠癌患者二氢嘧啶脱氢酶基因多态性与 5-FU代谢及临床意义探索姓名：章宏申请学位级别：博士专业：内科学（消化系病）指导教师：厉有名20060201浙江大学博士学位论文第一部分人巨噬细胞金属弹性蛋白酶在胃癌细胞及胃癌组织中的表达及临床意义目的浙江大学医学院搏士研究生导师内科学( 消化系病)章宏厉有名教授中文摘要人巨噬细胞金属弹性蛋白酶( H M E ) 是M M P 家族的员，又称M M P 1 2 。它有强的降解细胞外基质( E c M ) 的能力，故可渗透基底膜，侵袭正常和肿瘤组织；但H M
2、 E 同时可把纤维蛋白溶酶原转变为血管抑素( a I l g i o s t a t i n ) ，从而限制血管生成，抑制肿瘤的生长和侵袭。由于H M E 是M M P 中较新的成员，对它的研究尚少，关于它在肿瘤中的表达水平及意义有很多争论。国内无此方面的研究。从国外现有的资料看，它在不同肿瘤中的表达意义不一致。关于胃癌和H M E关系的文献国内外均未见报道。本研究测定三株胃癌细胞株( M G c ，8 0 3 、s G c 7 9 0 l 、A G S ) 和胃癌患者组织标本( 包括肿瘤组织、癌旁组织、远处正常组织) 中的H M E 表达水平。使用I m P C R 、荧光定量P C R 测
3、定H M 匣基因表达，采用w s t e mB l o t 和免疫组化测定H M E 蛋白表达。分析瑚怔在胃癌患者中表达水平和在胃癌发生和发展中的作用及对预后判断的意义。材料与方法1 临床资料所有病例取自浙江大学医学院附属第一医院2 0 0 3 年4 月2 0 0 3浙江大擘博士学位论党年8 月问胃肠外科和肿瘤外科胃癌住院手术病人。共5 8 例，其中男性4 3 例，女性1 5 侧；年龄最大7 6 岁，最小3 2 岁，平均5 S 5 l o 6 多。所有胃癌意辔组织标本均包攒j 狰癌组织、癌努组织、远处正常组织。标本离体半小时内采样* 2 0 0 液氮保存铸用。2 缨琏壤券霉薅缎瑰拣M G c
4、8 0 3 、s o C 7 粥l 、A G s 赡于中科院上海缨驻生物研究所。常规纲胞培养，培养基为R P M I l 6 4 0 细胞培养基( 美囡G I B C 0 公司)宓霪1 0 ，l 、牛盘清( 辕翊器拳青公溺) ，零簇缨燕称M G C 8 0 3 、S 聪C 。7 粥l 、A G S在含1 0 小牛血清的培养液R P M I l 6 4 0 中，于3 7 、5 C 0 2 条件下培养，每2 3 必传代一次。取艇长状态良好、达9 0 融合的鞠脆俸为磺究对象。3 R T - P C R 检测H M E m R N A 表达总R N A 提取：取上述培养细胞和三种组织标本各1 0 0
5、m g 分别加入1 H z o ll m l ，破孬孳层熬缨魏窝碾耱螽豹缌织样本分别转移懋无鼢淞酶秘无D N A 黪豹1 5 m lE p p e n d o r f 管，然后根据试剂说明书抽提R N A ，最后用D E P c 处理水溶解R N A 。提取茨憨赋A 经絮辨势必毙疫诗测定提联物赘浓麓，O D 2 6 舱g e 魄僮在1 8 以0 之删。逆转聚反应；嗣上述簸瑾后样本中据敬的2 隧总融A 在下述2 0 弘l 反应体系中逆转录成c D N A ，该反应体系组成如下：5 R T - B u 妇4 m ，o l i g o d T ( 1 8 ) 2 5 岬o l ，Ll l ，d N
6、T p5 m m o l 彪l 肛l 。R N A a s i n( R N A 酶抑制剂)2 0 U ，去离子求约1 3 耻l 。7 0 预变键5 m i n ，然后热入M M v 逆转录酶2 0 0 u ，4 2 孵育l l l ，7 2 加热1 0 m i n 灭活逆转录酶。愆R 反应：取上述逆转录反殿产躲2 玲予2 0 堪轰应搭软孛遴嚣p c R 反应。反成体积组成如下：1 0 B u 舵r 2 肛l 、d N T P l O m m I O 4 “l 、M g C l 22 5 m m o 肌1 4 叫、 2 5 u 鞠渊A 聚合簿O 5 瓣、模扳2 鹰、上、下游黪异雩| 魏2 啦o
7、 l 各e 。5 l 、去褰子水1 2 7 “l 。引物序列为5 T G G C c A T T C c l l A O G T c T T G - 3 朔5 一A A G c A 0e 联C A A 瞄C c A G 雒：3 。先在9 4 交往3 m n ，然螽按下述条 宰徭薜3 0 次：交性9 4 2 0 s 、退火6 1 2 0 s 、延伸7 2 3 0 s ，最后7 2 延伸1 0 m i n ，4 0 e 冷却5m 融结束反应。然精进行琼脂糖溉泳。4 实时荧光P c R 检测H M E m R N A 表达2浙江走学博士学位论文取上述逆转录反应产物4 于4 0 扯l 反应体积中进行R
8、 e a l t i m eP C R 反应。反 应体积组成如下：l o B 硼融4 H l 、姗l O m m 蓬，O 8 湃、M g C l 2 2 5 H 撇o l 屋，2 p l 、2 5 UT a q D N A 聚合酶O 。5 啦、模板4 m 、上、下游特异引物各l m 、特异性探针O - 3 出，去离子水2 6 4 l 。弓| 物序列为5 T G A A A G T G A C C G G O C A A C 3 和5 G G AT T G C G T A G T C A A C A T c C 下C 3 ，探针序列为5 F A M A T G C A C G C A C C T
9、 C G A T GT G G A G T C C T A M R A 。先9 4 变性3 m i n ，然后按下述条件循环4 0 次：9 4 1 0 s 、锄s ，6 0 采集光源。5 W j s t e mB l o t 检测H M E 蛋白表达捷取上述珞葵豹缨熬，惹羲滋糟s 洗涤一次，热天5 0 0 斗lc e l l 趣s i s ，珠上放鼹1 0 m i n ，用自制细胞刮刮下细胞；癌缀织、癌旁组织、f E 常组织各取1 0 0 I n g ，矮糟s 洗涤一次，潮入5 0 0 瓣c e l lL y s i s ，糟玻璃驾浆器磷磨：取上述楚壤后熊细胞和组织样本，4 低温离心1 2 0
10、 0 0 转m i n x1 0 m i n ，吸取上清到E p p e n d o r f 管中；用蛋酝定量试剂盒定鬃，联8 0 p g 蛋自作电泳并转膜；先后加入一抗( 兔抗M M P 一1 2 多克隆抗体作为抗，工作浓度为1 ：l O O O ) 和 R P 耦联的二抗；E C L显影：使用B i o s e I l s eg e l 洳a g i n gS y 蜘m 进行分析。6 + 兔疫缀纯检测糙讧E 蛋怠表达使用E n v i s i o n 二步法行免疫缎化分析。切片5 微米，脱蜡至水：阻断内源性：蓬戴纯蘩酶( 1 9 8 瘫爵甲黪+ 2 毫秀3 0 H 2 。2 ) 室滋2 0
11、 分镑，求洗：p 珏? 。2 缓冲液洗三次；抗原修复液内微波修复2 0 分钟：p H 7 + 2 缓冲液洗三次：滴加脏常血清，3 7 舀，2 0 分镑；擦去多余纛清，麴受藏熊嵇1 2 多竞瀣拣体终羹撬，工作浓度为1 ：1 0 0 0 ，3 7 O ，6 0 分钟；p H 7 2 缓冲液洗三次；滴加E n v i s i o n 二抗，3 7 O ，6 0 分锋：p 王7 2 缓、绅滚洗三次；D A B 显截l o 分锋；水流；苏本繁淡染，蓝化，脱水，透明，封固。结果1 脊癌细胞株检测结果胃癌细胞株M G C 8 0 3 、S G c 7 9 0 l 、A G SH M Em R N A 常嫂赆
12、P c R 检测结果均为阳性。采用实时荧光P C R 对三秘胃癌细胞株的H l 诬Bm 鼢淞进行定量检测，每份样本均根据B a c t i I l 的拷贝数进行校最，P c R 扩增模坂中含l 妒拷燹数转。a 醍n 偌荛内参铰准。安封荧强P c R 捻测结暴也均戈羯性，3浙墨太学博士学位论史上逖细胞株中m d Em R N A 检测定量值为8 3 7 l0 5 、2 5 4 1 0 5 朔1 。8 5 1 0 4 。w e s t e mB l o t 检测结果显承H M E 缀自表达在上述三个细胞株中落为阳馥，光密度季曩描值分别为3 7 8 4 、2 7 1 9 和3 3 7 5 。2 临床
13、胃癌组织 采本检测结果2 1 霉瘥绻织据本辍沮妇R N A 检测结果( 1 ) R t n P C R 对5 8 例胃癌患者癌组织、癌旁组织和正常组织的H M E m R N A遴镗憨：雕骁捡嚣，结果发瑗痉缀织、瘗旁组织秘正豢缓绞豹H M 琶m 列A 阳性率分别为2 4 1 4 、2 0 6 9 和6 9 0 ，三组间差异商统计学意义，P o 0 5 ；癌组织阳後率高于正拳缀缓，差菇有统嚣学意义，P 瑶。0 5 ；癌旁缀缀疆谯率离予歪常缝织，差异有统计学懑义，P O 0 5 ；癌组织阳性率高乎癌旁组织，熬异无统计学意义，0 国5 。P c R 扩增产物图象分析表碉，憋揠m 鼢醴程组织审表达率魔
14、在瘙组织中最黼，其次分别是瘸旁组织和正常缀织。( 2 ) R e a l I t i m eP c R 采用实时荧光P C R 对胃癌组织、癌旁缀织和蕊常组绞的撇咀! 硝淡A 进譬亍定量梭测，每份样本均根据8 a c t i n 的拷贝数进行校豫，P c R扩增模板中含1 驴拷贝数D ，a c t h l 作为内参梭准。结果表明褥癌组织、癌旁组织和正常组织鲍 王氛纯黼礤q A 辍性率3 l + 0 3 、2 5 8 7 、1 8 。9 7 ；癌缀织阳性率蹇于癌辩组织、癌旁组织阳性率高于正常组织，但差异无统计学意义，P O 0 5 。阳性结繁拷哭数鼹数毽分裂荛6 。沩O 。7 6 、3 。9 7
15、 1 鸵鞠3 3 8 士O 8 0 ，三组瓣差努有统计学意义，P O 0 5 。( 3 ) 臀癌患者巾H M E 捌R N A 的表达与预后的关系根椐R e a l 撕m eP c R 稔测的结果，把簿痦患者分为瑚惦m R N A 表达阳性组与辨性组，进行辫癌患者H M Em R N A 表达与胃癌患者预后的分辑。其中H M E m R N A 阳性1 8 例，阴性4 0 例。m 诬m R N A 表达与否和肿瘤的位置、大小、浸瀵深疫、恶性程发、嚣芬基毽轮p 、囊| 蓼基霆P G P 无关。疆M 戳A 礤瞧患者淋熙结转移发生率小于阴性者，藏异有统计学意义( P O 0 5 。阳性患者H M E
16、 蛋白定量结果分别为3 3 5 8 1 0 5 3 、2 8 9 l 9 7 4 和2 3 0 5 9 1 5 ，三组间差异有统计学意义，P 0 0 5 。( 2 ) 免疫组化免疫组化H M E 染色定位于肿瘤细胞、问质细胞、血管内皮细胞和神经细胞，胞浆着色。规定阳性细胞 5 0 为阳性+ + 。结果发现正常组织中阴性5 4 例，阳性+ 有4 例( 6 9 ) ：癌旁组织中阴性4 9 例，阳性+ 有4 例( 6 9 ) ；阳性廿有5 例( 8 6 ) ：胃癌组织中阴性2 0 例，阳性+ 有8 例( 1 3 8 ) ；阳性H 有3 0 例( 5 1 8 ) 。三组间H M E免疫组化检测结果差异有统计学意义，P O 0 5 。结论1 在胃癌细胞株M G C -
