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1、单抗标记单抗标记目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形式提供，其中核心试剂为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。1. 酶标记（1） 辣根过氧化物酶（HRP）标记辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是 HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与 IgG 氨基结合，形成 Schiff 氏碱。为了防止 HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定 Schiff 氏碱。这里介绍两种程序。程序一：A. 将 5
2、mg HRP 溶于 0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中；加 0.5ml 10mmol/L NaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用 2 小时。B. 加 0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。C. 加入 0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml） ，混匀。D. 称取 Sephadex G25 干粉 0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的 5ml 注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3 小时或 4过夜。E. ?用少许 PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V 体积新鲜配制的 5mg/ml NaBH4 溶液
3、，混匀，室温作用 30 分钟；再加入3/20V NaBH4 溶液，混匀，室温作用 1 小时（或 4过夜） 。F. 将交联物过 Sephadex G200 或 Sepharose 6B（2.650cm）层析纯化，分管收集第一峰。G. 酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量（mg/ml）=OD4030.4IgG 量（mg/ml）=（OD280-OD4030.3）0.62克分子比值（E/P）=酶量4/IgG 量，一般在 1-2 之间。酶结合率=酶量体积/抗体，标记率一般为 0.3-0.6，即 1-2 个 HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280 等于
4、 0.4 时，E/P 约为 1。标记率=OD403/OD280酶活性和抗体活性的测定 可应用 ELISA 法、免疫扩散、DAB-H2O2 显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。H. HRP 抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20存放，防止反复冻融；或加入等量 60%甘油 4保存；不宜加 NaN3 或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以 BSA 或脱脂牛奶作保护剂。程序二：A. 将 5mg HRP 溶于 0.3mol/L PH8.1 NaHCO3 溶液中，加入 1%二硝基氟苯无水乙醇溶液 0.1ml，室温搅拌作用 1 小时，以封闭 HRP 分子上的 和 氨基。B
5、. 再加 1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅 30 分钟，溶液呈黄绿色；随后加 1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅 1 小时，中止氧化反应。C. 移入透析袋中，在 1000ml 0.01mol/L PH9.5 碳酸盐缓冲液中，4透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。D. 吸取上述醛化好的 HRP 溶液 3ml，加入 5mg IgG 的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅 2-3 小时，避光；加入 5mg NaBH4 ，4放置 3 小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用 7 小时。E. 再移入透析袋中，在 0.02mol/L PH7.4 PBS
6、中透析 24 小时，更换三次缓冲液。F. 用 3000r/min 离心 30 分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许 PBS 溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。G. 步骤同程序一。（2） 碱性磷酸酶（AP）标记碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的 NH2 分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下：A. 将 5mg AP 加入 1ml 抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于 4对 0.01mol/L PH7.2 PBS 透析 18 小
7、时，换液三次。B. 加入 2.5%戊二醛 20ul，室温作用 1-2 小时，4对 PBS 透析过夜，其间换液三次C. 换用 0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl 缓冲液透析，4过夜，换液三次。D. 取出标记抗体，用含 1%BSA 的 Tris-HCl 缓冲液稀释至 4ml，即为 AP 标记物原液。E. 每毫升中加入 0.4ml 甘油，小量分装，保存备用。（3） PAP、APAAP 的制备PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术） 、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术）的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和
8、兔 PAP、APAAP 试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为 PAP 法和 APAAP 法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP 和 APAAP 试剂的制备方法常采用先将 HRP 或 AP 加入抗 HRP 或 AP 的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调 PH 至 2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化 PAP 或APAAP。根据需要还可将 PAP 和 APAAP 试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法
9、用于诊断或检测试验等。2. 荧光素标记（1） 异硫氰酸荧光素（FITC）标记FITC 标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG 的自由氨基结合，形成 IgG 与荧光素的结合物。FITC 是最常用的荧光素，其次选用 TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明） 。FITC 和TRITC 是常用的双标记组合。其标记步骤如下：A. 以碳酸盐缓冲液（PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸馏水1000ml）调整抗体浓度至 10mg/ml。B. 取 5ml 抗体溶液置于 10ml 小烧杯中。C. 称取 1mg FITC 溶于 0.2ml DMSO 中，待溶解后立即缓慢滴
10、加于抗体液内，边加边轻搅；其后室温避光作用 2 小时。D. 将交联物经 Sephadex G25 或 G50 柱层析除去游离的荧光素；分管收集第一峰为标记的抗体。E. FITC 的结合物质量鉴定IgG 量（mg/ml）=（OD280-OD4950.35）/1.4F/P=2.87OD495/（OD280-OD4950.35） ，一般说，FITC 对抗体的摩尔比为 3：1 时适合于组织切片染色，为 5-6：1 时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。F. 标记抗体的保存：宜保存于 4，加 NaN3 防腐。（2） 异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记:基本与
11、 FITC 标记相同。3. 同位素标记 必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应包括避免物理的接触和对 -射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。（1） 碘标记用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I 衰变产生低能的 和 射线，很容易被检测出来，而其 60 天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。最常用的碘标记方法是氯胺 T 法，即将氧化剂氯胺 T 加入到抗体和碘化物的溶液中，Na125I 在氯胺 T 作用下 I 转化成 I2，游离 I2 可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤
12、化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其主要操作步骤如下：A. 在进行标记之前，先选用截流分子量为 20000-50000 的凝胶，制备 1ml 凝胶柱，然后分别用 10 倍体积的 1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和PBS 洗涤柱体，封住柱下口，备用。B. 加入 10ug 纯化单抗至含有 25ul 2.5mol/L 磷酸钠（PH7.5）的1.5ml 指形管内。随后，加入 500uCi Na125I 混匀。C. 加入 25ul 新配制的 2mg/ml 氯胺 T。室温放置 60 秒。再加入50ul 氯胺 T 终止液（含 2.4mg/ml 偏重亚
13、硫酸钠，10mg/ml 酪氨酸，10%甘油和 0.1%环乙烷酰二甲苯的 PBS） 。D. 将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1.5ml 指形管收集。当碘标记物全部进入柱体，加入 0.3ml 含 0.03%叠氮钠的 PBS，用另一指形管收集 0.3ml，然后再加 0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集 0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体大约在第二至第四管出现。无害化处理柱子和非单抗标记部分。E. 将标记单抗保存于 4可使用 6 周时间。（2） 生物合成法标记将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同
14、位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。其主要步骤是：A. 离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需 2106 个细胞。以预热 37不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。B. 用含 2% PBS 不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至 106 个/ml，加入 35S 甲硫氨酸（每次加入 100uCi 可产生 105-106cpm 的抗体） 。C. 经 C02 培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入1/20 体积的 1mol/L Tris（PH8.0）及叠氮钠至浓度 0.02%。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。4. 生物素标记生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进
15、行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。其主要步骤是：A. 用二甲基亚砜配制 10mg/ml 的 N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯） 。B. 用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，PH8.0）稀释单抗溶液至 1-3mg/ml。C. 每毫克抗体加入 25-250ug 的生物素酯，混匀后，室温作用 4 小时。D. 按每 250ug 生物素酯加入 20ul 1mol/L NH4Cl 终止反应，室温放置 10 分钟=生物素标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性，生物素标记的抗体可存放多年而不失活。能与生物素结合的二级试剂为亲和素和链霉亲和素，所需的
16、各种标记物均可购置。此外，亲和素和链霉亲和素的结合背景水平非常低结合紧密且快速。故可消除多步骤程序中的许多缺点。生物素拯记尥王要优点是标记一抗后，再选用亲和素或链霉亲和素标记的二级试剂进行测定。抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料或放射性碘的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。链霉亲和素及亲和素与生物素的亲和力非常高(Ka1015Lmo1)，并且二者间的相互作用实质上是不可逆的。由于链霉亲和素的等电点（pI）更适宜故其更常用，背量也因此较低。将生物素与抗体共价结合是一种非常简便和直接的标记方法。通常，生物素对抗体并无负面影响且标记条件温和，用亲和素或链霉亲和素标记试剂进行检测的敏感性与使用标记抗 IZ 抗体相同。Becker 和 Wichek(1972)、Heitzmann 和 Richards(1974)及Heggeness
