《Chk1的细胞定位及不同缺失突变体修复活性的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Chk1的细胞定位及不同缺失突变体修复活性的研究（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、C h k l的细胞定位及不同缺失突变休修复活胜的研究北京师范大学硕士学位论文C h k 1 的细胞定位及不同缺失突变体修复活性的研究摘 要细胞中的D N A分子易受到各种因素的损伤，为了维持基因组的稳定性，细胞在进化中建立和发展了 检验点 机制探测基因组紊乱， 通过感受蛋白、传感蛋白、中 介蛋白 和效应蛋白组成的复杂网络信号 传导通路启动应答反应。效应激酶C h k l 是一种在进化过程中保守的蛋白 激酶， 它是联系D N A完整监控器和细胞周期引擎的关键介导蛋白。本论文中， 将着重研究保守效应激酶C h k l 在细胞中的定 位和不同缺失突变体修复活性。 /首 先 通 过R T P C R
2、 技 术 从H e la 细 胞 总R N A 中 克 隆 得 到C h k l 基 因 全 长 。利用获得的C h k l 基因c D N A ，成功构建了C h k l 及不同C h k l 缺失突突体的p E G F P - C l 重组质粒， 包括p E G F P - C 1 - C h k l , p E G F P - C l - C zL 2 8 8 , p E G F P - C l -C L3 3 4 , p E G F P - C 1 - C L3 6 8 和p E G F P - C l - C 43 5 5 ， 通过转染研究不同C h k l的缺失突变体在中 心体的定
3、位和损伤后的核定位状况。还构建了真核表达载体p X J 4 1 - C h k l , p X J 4 1 - C L2 8 8 , p X J 4 1 - C L3 3 4 和p X J 4 1 一 C L3 6 8 ，通过与报告质粒p E G F P - N 2 共转染细胞研究了不同的C h k l 缺失突变体的修复能力，同时还研究了不同的 C h k l缺失突变体对细胞周期的影响，从这两方面来研究 C h k l 的调控结构域对激酶结构域的调控。研究结果表明决定C h k l 的中心体定位的序列存在于C末端1 2 1 个氨基酸残基 ( 3 6 8 - 4 7 6 )中，决定损伤诱导的C
4、h k l 核滞留的序列存在于C端调控结构域中的2 4 个氨基酸残基 ( 3 3 4 - 3 6 8 )中。通过C端调控结构域不同长度的缺失，检验了C 末端缺失对C h k l 活性的影响，结果发现C末端缺失1 3 4个氨基酸残基 ( 3 3 4 - 4 7 6 ) 的C L3 3 4 及缺失1 0 8 个氨基酸残基 ( 3 6 8 - 4 7 6 )的 C A 3 6 8 活 性比 全 长C h k l 强， 而 且C A 3 6 8 能 延 迟 细 胞 周 期进 程， 但C 末 端缺失1 8 8 个氨基酸残基 ( 2 8 8 - 4 7 6 )的C A2 8 8 几乎没有酶活性，说明调控结
5、构域包括抑制和激活元件，这为以后深入研究C h k l 提供了有用的帮助。关键词:细胞周期，C h k l ，中心体定位，结构域C h k l的细胞定位及不同缺失突变体修复活性的1 ) f 究北京师范大学硕士学位论文R E S E AR C H O N C E L L UR L O C A T I O N O FC HKI AN D RE P A I R AC T I V I T I E S O F D I F F E R E NTT RUNC AT I ON MUT ANTSABSTRACTD N A m o l e c u l e s a r e v u l n e r a b l e t
6、 o v a r i o u s f o r m s o f e r r o r s , t o m a i n t a i n g e n o m i c i n t e g r i t y ,c e l l s h a v e e v o l v e d me c h a n i s m s k n o w n a s c h e c k p o i n t s t h a t d e t e c t g e n o m i c p e rt u r b a t i o n a n di n i t i a t e a r e s p o n s e t o c o p e w i t h
7、 i t t h r o u g h a c o m p l e x n e t w o r k o f s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y sc o n s i s t i n g o f s e n s o r s , t r a n s d u c e r s , a n d e ff e c t o r s . E ff e c t o r k i n a s e C h k 1 i s a n e v o l u t i o n a ri l yc o n s e r v e d p r o t e i n k i n
8、a s e , a n d C h k l i s t h e k e y m e d i a t o r s t h a t l i n k t h e ma c h i n e r i e s t h a t m o n i t o rD N A i n t e r g r i t y t o c o m p o n e n t s o f t h e c e l l c y c l e e n g i n e . I n t h i s p a p e r w e f o c u s o n t h e c e l l u rl o c a t i o n o f e ff e c t
9、o r k i n a s e C h k l a n d r e p a i r a c t i v i t y o f d i ff e r e n t t r u n c a t i o n m u t a n t s o f h u m a nCh k l .We c l o n e d C h k 1 g e n e f r o m t h e t o t a l R N A e x t r a c t e d fr o m H e l a c e l l s t h r o u g h R T P C R . R e c o m b i n a n t v e c t o r s
10、p E G F P - C l - C h k l / C A2 8 8 / C A3 3 4 / C A 3 6 8 / C A 3 5 5 w e r e c o n s t r u c t e d a n dt r a n s f e c t e d i n t o H e l a c e l l s t o s t u d y t h e c e n t r o s o me l o c a t i o n a n d D N A d a m a g e - i n d u c e d n u c l e a rr e t e n t i o n o f d i ff e r e n
11、t t r u n c a t i o n m u t a n t s . R e c o m b i n a n t e x p r e s s in g v e c t o r s p X J 4 1 - C h k l / C A 2 8 8 / C A 3 3 4 / C A3 6 8 w e r e c o n s t r u c t e d a n d c o - t r a n s f e c t e d i n t o H e l a c e l l s w i t h r e p o rt e rp l a s m i d s p E G F P - N 2 t o l e
12、a rn t h e r e p a i r c o mp e t e n c e o f d i ff e r e n t t r u n c a t i o n m u t a n t s o f h u m a nC h k 1 , a n d r e c o m b i n a n t e x p r e s s i n g v e c t o r s w e r e t r a n s f e c t e d i n t o H e l a c e l l s t o s t u d y e ff e c t s o n t h e c e l l c y c l e o f d i
13、 ff e r e n t t r u n c a t i o n m u t a n t s , s t u d y i n g r e g u l a t i o n o f k i n a s e d o m a i n b y r e g u l a t o r yd o m a i n f r o m t w o a s p e c t s .T h e r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i me n t s c o n f i r m e d t h a t t h e c e n t r o s o me l o c a t i o n
14、s e q u e n c e o f C h k li s i n t h e C - t e r mi n a l 1 2 1 a m i n o a c i d s ( 3 6 8 - 4 7 6 ) , a n d D N A d a m a g e - i n d u c e d n u c l e a r r e t e n t i o ns e q u e n c e i s i n 2 4 a m i n o a c i d s ( 3 3 4 - 3 6 8 ) o f C - t e r m i n a l r e g u l a t o r y d o m a i n .
15、 C o n s t r u c t i n gd i ff e r e n t C - t e r m i n a l t r u n c a t i o n m u t a n t s t o d e t e r m i n e e ff e c t s o n C h k l a c t i v i t y o f C - t e r m i n a l t r u n c a t i o n , t h e s e r e s u l t s r e v e a l e d t h a t t h e e n z y m a t i c a c t i v i t y o f C 03
16、 3 4 m i s s i n g t h e C - t e r m i n a l1 3 4 a m i n o a c i d s ( 3 3 4 - 4 7 6 ) a n d C L3 6 8 m i s s i n g t h e C - t e r m i n a l 1 0 8 a m i n o a c i d s ( 3 6 8 - 4 7 6 ) a r e h i g h e r t h a n f u l l - l e n g t h C h k l , a n d C A 3 6 8 d e l a y s c e l l c y c l e p r o g r e s s i o n , C A2 8 8 m i s s i n g t h e C - t e r m i n a l 1 3 4 a m i n o a c i d s ( 3 3 4 - 4 7 6 ) a l m o s t h a s n o e n z y m a t i c a c t i v i t y s u g g e s t i n g t h a
