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1、耐药相关基因在卵巢耐药相关基因在卵巢 癌组织中的表达及其癌组织中的表达及其 临床意义临床意义中华妇产科杂志 2000 年第 2 期第 35 卷 论著作者：程国钧 祝华 孙丽亚 李亚里 李春海 杨秀玉单位：程国钧（100853 北京，解放军总医院妇产科） ；祝华（100853 北京，解放军总医院妇产科） ；李亚里（100853 北京，解放军总医院妇产科） ；孙丽亚（军事医学科学院） ；李春海（军事医学科学院） ；杨秀玉（中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科）关键词：卵巢肿瘤；基因；MDR；多药耐药相关蛋白；谷胱甘肽转移酶摘 要：目的 通过测定多药耐药基因（MDR1） 、多药耐药相关蛋
2、白（MRP） 、肺耐药相关蛋白（LRP）和谷胱甘肽 S-转移酶（GST-）在卵巢癌组织中的表达，了解其在卵巢癌化学治疗耐药中的作用。方法 采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定了 41 例卵巢癌、25 例良性卵巢肿瘤和 12 例正常卵巢组织中 MDR1、MRP、 LRP 和 GST- 的表达，并分析其与临床、病理特征的关系。结果 (1)在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中，MDR1 的阳性表达率分别为 0.0%、0.0%和 29.3%；MRP 阳性表达率分别为 16.7%、12.0%和 53.7%；LRP 阳性表达率分别为 25.0%、52.0% 和 87.8%；GST- 阳性表达率分
3、别为8.3%、12.0%和 51.2%。上述 4 项指标在卵巢癌组织中的表达均明显高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织（P0.05） 。 (2) 耐药基因在卵巢癌组织中的共同表达现象明显多于良性卵巢肿瘤和正常卵巢（P0.05） 。(3) 临床期卵巢癌组织中，MDR1和 MRP 的阳性表达率分别为 33.3%和 60.6%，高于临床期（期 8 例中 1 例，期 8 例中 2 例） ，但差异无显著性（P0.05)。不同期别的卵巢癌组织中 LRP 和 GST- 的阳性表达率相近（P0.05)。 (4)MDR1、MRP、LRP 和 GST- 的表达与肿瘤病理类型无关（P0.05)。 (5) 低分化卵巢癌组织
4、中MDR1 和 MRP 的阳性表达率分别为 50.0%和 72.7%，明显高于中、高分化卵巢癌的 5.3%和 31.6%（P0.01） ，而 LRP 和 GST- 在低分化卵巢癌组织中的阳性表达率分别为 90.9%和 59.1%，与中、高分化卵巢癌的 84.2%和 42.1%比较，差异无显著性（P0.05)。(6) 化疗疗效不佳者的耐药基因共同表达现象普遍，MDR1 和MRP 的阳性表达率在化疗无效者中分别为 50.0%和 83.3%，明显高于化疗有效者的 7.1%和 28.6%（P0.05） 。结论 耐药相关基因在卵巢癌组织中的表达高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织，共同表达现象普遍，化疗耐药与
5、 MDR1 和 MRP 阳性表达的关系较大。The Expression of Multiple Drug Resistance Associated Genes in Ovarian CancerCHENG Guojun ZHU Hua SUN Liya et al（Department of Obstetrics and Gynecology，Chinese Peoples Liberation Army General Hospital, Beijing 100853, China）Abstract：Objective The aim of the investigation was t
6、o find out the relationship between the expression of multidrug resistance gene (MDR1), multidrug resistance protein (MRP), lung resistance protein (LRP) and glutathione S-transferase pi(GST-) with the clinical pathological characteristics and the prognosis in the ovarian cancer patients who never r
7、eceived chemotherapy before operation. Methods The expression of MDR1, MRP, LRP and GST- in 41 cases of ovarian cancer, 25 cases of benign ovarian tumor and 12 normal ovary tissue were investigated by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）. Results In normal ovary, benign tumor and
8、ovarian cancer, the positive expression of MDR1 was 0.0%, 0.0% and 29.3%, the positive of MRP was 16.7%、12.0% and 53.7%, the positive of LRP was 25.0%、52.0% and 87.8%, the positive of GST- was 8.3%、12.0% and 51.2% respectively. The ratios of co-expression of multiple genes in ovarian cancer were muc
9、h higher than that in benign ovarian tumor. All tested genes showed no significant relationship to the clinical stage, histological type and the differentiation of the tumor except that the expression of MDR1 and MRP was closely related to the differentiation (P0.05). The non-responders to platinum
10、or taxol based combination chemotherapy exhibited higher ratios of MDR1 and MRP expression than the responders (P0.05). Furthermore, the co-expression phenomenon was more common in non-responders. Conclusions Multiple gene expression is involved in drug resistance in ovarian cancer. The co-expressio
11、n of MDR1, MRP, LRP and GST-is higher in ovarian cancer than that in benign ovarian tumor and normal ovary tissue. The expression of MDR1 and MRP is closely related to the tumor differentiation and the response to chemotherapy.Key words：Ovarian neoplasms； Genes, MDR； Multidrug resistance associated
12、protein； Glutathione transferases对化学治疗（化疗）耐药是卵巢癌治疗失败的主要原因之一。国内外研究表明，肿瘤耐药涉及细胞内药物浓度降低、药物靶分子改变、代谢解毒、DNA 损伤修复功能增强等多种机理，与多种耐药相关基因有关1 。本研究采用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，同时测定了多药耐药基因（MDR1） 、多药耐药相关蛋白（MRP） 、肺耐药相关蛋白（LRP）和谷胱甘肽 S-转移酶（GST-）等多个耐药相关基因在卵巢肿瘤组织中的表达, 以了解其意义。资料与方法一、研究对象选自 1995 年 1 月至 1997 年 12 月间，在解放军总医院妇产科住院进行
13、手术治疗的患者共 78 例，其标本均经病理检查证实。其中卵巢良性肿瘤 25 例；卵巢癌 41 例；另取正常卵巢 12 例（因妇科良性疾病手术切除）作为对照。卵巢良性肿瘤包括浆液性上皮瘤 10 例，粘液性上皮瘤 7 例，成熟畸胎瘤 6 例，良性Berner 瘤 1 例，卵巢冠囊肿 1 例。卵巢癌包括浆液性乳头状囊腺癌（浆液癌）20 例，粘液性乳头状囊腺癌（粘液癌）5 例，透明细胞癌 7 例，子宫内膜样癌 2 例，未分化腺癌 6 例，内胚窦瘤 1 例。其中，临床期 3 例，期 5 例，期 30 例，期 3 例，36 例在术后 1 周内开始化疗，共接受了 613 个疗程的化疗，方案以 PAC（顺铂，
14、阿霉素，环磷酰胺）或泰素加PC（顺铂，环磷酰胺）方案为主。二、方法1标本收集：手术切除后 1 h 内，将标本置于液氮保存。所有病例在手术前均未接受化疗。2.引物设计：根据从 Genbank 中查到的各基因序列设计聚合酶链反应（PCR）引物，分别为MDR1：5GTACCCATCATTGCAATAGC3，5CAAACTTCTGCT- CCTGAGTC3；GST-：5CAGGAGGGCTCACTCAAA- G3，5GATCAGCAGCAAGTCCAGCAG3； MRP：5ATGGACTACACAAGGGTGATCG3，5TCCGCATCTCT- GTCTCTCC3；LRP：5GAGCAGTTCACA
15、GTGTTGT- CC3，5AAAGCCAAAGACAGCAGTGCG； 内参基因肌动蛋白(-actin)：5ACACTGTGCCCATCTACGAGG3，5AGGGGCCGGACTCGTCATACT3。 MDR1、GST-、MRP、LRP 和 -actin 的扩增片段的长度分别为 167bp、350bp、337bp、342bp 和 240bp。3RNA 提取：参照 TRIzol 试剂盒（美国 GIBCO BRL 公司产品）说明书进行。4逆转录(RT)合成 cDNA：将 RNA 稀释为 1 g/l。取 5 l RNA 加 5RT buffer 4 l， dNTP(2 mmol/L) 1 l,
16、Oligo(dT) (100 g/l) 2 l, 三蒸水 3 l, 65水浴变性 5 min，加 RNasin（20 U/l）0.5 l, AMV(10 U/l)1 l （均为美国 Promega 公司产品） 。 42水浴 60 min。95 5 min 灭活 AMV。5PCR 扩增及电泳：（1）扩增体系：10buffer 1 l, dNTP (2 mmol/L) 1 l, 引物(5 mol/L)各 1 l, 甲酰胺 5 l ，cDNA100 ng, Tag DNA 聚合酶（4 g/l） 0.3 l，加三蒸水补充体积至 10 l。94变性 5 min 后进入循环，94变性 30 s，55 退火 30 s, 72延伸 1 min, 30 个循环后 7210 min。PCR 对照：每次 PCR 均设立阴性对照(加 1 l H2O 代替 cDNA)和阳性对照(分别加 1 l 含 MDR1、MRP、
