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1、河北医科大学例学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名：巍砝强导师签章河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独
2、立撰写，文责自负。研究生签名：童触建辫=薅“鏊H E 一马霞嘲7铡帅导少艚咖蒯砂学级二条滞1习为满1 q孙圹菇一私章叫辞叫J y导目录中文摘要1英文摘要4研究论文丁苯肽对缺氧致P C I 2 细胞损伤保护作用的比较蛋白质组研究前言8刖舌8材料与方法9结果1 2附图1 4附表17讨论2 0结论2 5参考文献2 5综述脑血管疾病蛋白质组学研究进展2 9致谢4 1个人简历4 2中文摘要丁苯肽对缺氧致P C | 12 细胞损伤保护作用的比较蛋白质组研究摘要目的：缺血性卒中是最常见的一种脑血管疾病，死亡率和致残率均较高，严重危害人类的健康和生活质量。其病理机制在于，供应脑部血液的颅外或颅内动脉发生闭塞性
3、病变，使局部脑组织的代谢需求与血液供应之间发生不匹配所致脑组织缺血缺氧的一系列病理变化，包括：细胞能量代谢异常、酸中毒、钙失稳态、自由基毒性、炎症反应等。丁苯酞可增加缺血区脑血流量，改善全脑缺血后脑的能量代谢和脑缺血区微循环，抑制炎症反应和钙内流，保护线粒体功能，减轻神经功能的损伤程度，缩小局灶性脑缺血后的梗死灶等，对缺血性卒中具有较佳的治疗保护作用。已有不少研究从不同角度对丁苯酞的作用机制进行了阐述，但目前尚未见到蛋白质组学层面的研究。系统了解药物治疗过程中特异的蛋白质变化将促进个体化的药物治疗的发展。这种变化能够被基于二维凝胶电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的蛋白质组学方法所鉴定。蛋
4、白质组学技术已经成为生命科学领域极其活跃的学科。比较蛋白质组学用于分析不同条件下蛋白质组的变化和差异，发现和鉴定不同生理状态下蛋白质组的差异，可在蛋白质水平提供关于疾病发生和细胞代谢等过程的整体而全面的认识。随着蛋白质组学技术和方法不断发展，将在药物作用靶点的发现、确认和药物多靶点研究等方面起到重要的作用，并将大大提高药物发现的效率。P C I 2 细胞是来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系，在形态、生理、生化等方面接近神经元，同时具有神经内分泌细胞和神经元的特性，经常被用于神经细胞死亡方式和神经毒性损害的研究。本研究通过比较蛋白质组学技术对拟缺血损伤P C I 2 细胞以及丁苯肽干预的P C
5、I 2 细胞进行研究，分离、鉴定差异表达蛋白，以期深入理解缺血性脑血管病发病机制及丁苯酞药物作用分子机制。方法：1 制作缺氧细胞模型。利用含二亚硫酸钠( N a 2 S 2 0 4 ，的无血清培养基处理P C12 细胞，建立细胞缺氧模型。2 丁苯肽作用于缺氧中文摘要损伤的P C I 2 细胞。M T T 代谢率测定P C I 2 细胞活性。观察丁苯肽对N a 2 S 2 0 4 导致的P C I 2 细胞缺氧损伤的保护作用。3 细胞蛋白提取，并进行第一向等电聚焦电泳、第二向垂直S D S P A G E 电泳后、以考马斯亮兰I 也5 0 显色。透射扫描双向电泳凝胶，所得图谱以I m a g e
6、 M a S t e r2 DE l i t e 软件进行图像分析。将感兴趣蛋白质点从考马斯亮兰染色的凝胶 上切下，胶内蛋白质酶解。以M A I ，D I T O F 们F 串联质谱技术结合数据库检索对蛋白质进行鉴定。结果：1 、不同浓度的N a 2 S 2 0 4 对P C I 2 细胞存活率的影响加入不同浓度的N a 2 S 2 0 4 后，P C I 2 细胞的生长受到不同程度的抑制，细胞胞膜缺损，胞体萎缩、脱落，细胞聚集。随着浓度N a 2 S 2 0 4的增大，细胞平均吸光度值逐渐降低。当N a 2 S 2 0 4 浓度大于等于 5 m m o l L 时，吸光度值与对照组有明显差异
7、( 尺O 0 1 ) 。2 、丁苯酞对N a 2 S 2 0 4 损伤的P C I 2 细胞的保护作用给予5 m m o l L N a 2 S 2 0 4 ，同时给予不同剂量的丁苯酞，随着丁苯酞浓度的增大，细胞平均吸光度值逐渐增加。当丁苯酞浓度大于等于1 0pm o l L 时，吸光度值与模型组有明显差异( 尸 9 8 ，用二甲基亚枫( D M S 0 ) 溶解，无血清培养基稀释。配制成浓度分别为2 0um o l L ，1 0um o l L ，1um o l L ，O 1um o l L ；新生胎牛血清购自杭州四季青公司( 室温融化后，5 6 水浴，补体灭活3 0 m i n ，室温冷却
8、后，4 冰箱 保存) ；D 溉M 无糖、高糖培养基购自G i b c o l 公司；青霉素，硫酸链霉素购自S i g m a 公司；M T T 购自华美生物工程公司；p H3 1 01 3 c mI P G 预制干胶条( P h a n I 】a c i a 公司，S w e d e n ) ，I P Gp H3 1 0 缓冲液( P h a n n a c i a 公司，S w e d e n ) ，D T T 、尿素、丙烯酰胺、蛋白酶抑制剂、N ，N 甲叉双丙烯酰胺、C H A P S 、T E M E D 、T P C K 处理过的胰蛋白酶( S g i m a 公司) ，三氟乙酸( 色
9、谱纯，A 1 “c hC h e m i c a l 公司) ，甲醇、乙腈等试剂( F i s h e r 公司) ，低分子量的标准蛋白质( 上海丽珠东风生物技术有限公司) ，秭s 、十二烷基硫酸钠、甘氨酸( S D S ，上海生工生物工程有限公司) 。1 2C 0 2 培养箱( 日本S A N Y O 公司) ；超净工作台，电子称，倒置显微镜，电热恒温干燥箱，酶标仪( 黄石市恒丰医疗器械有限公司) ；高压锅( S A N Y OA u t o c lA 、厂E S 3 0 2 0J a p a n ) ；G 1 6 型医用高速离心机( 河北安新县北冯) ；I P G p h o r 等电聚焦
10、系统( P h a m a c i a 公司，S w e d e n ) ，M A I ，D I T O F T O F 质谱仪：U l t r 小1 e x ( B m k e r 公司，德研究论文国) ，M A L D I T O F 质谱仪：a u t o n e x ( B 九水e r 公司，德国) ，H o e f e S E 6 0 0 S e r i e s 仪器( P h 锄a c i a 公司，S w e d e n ) ，B e c k m a nL 7 6 5 低温高速离心机( B e c k m a l l 公司，美国) ，I m a g e M a s t e r2
11、DE l i t e 图象分析软件( A m e r s h 锄p h a n n a c i ab i o t e c h 公司，瑞典) 等。2 方法2 1 细胞培养P C I 2 细胞复苏后在含有1 0 胎牛血清和各1 0 万单位L 青霉素、链霉素的高糖D M E M 培养基中，置于3 7 。C ，5 C 0 2 ，饱和湿度的C 0 2 培养箱中。隔天换液，4 至5 天传代一次。实验所用细胞处于对数增长期，且存活细胞百分率在9 5 以上。2 2 含连二亚硫酸钠的无血清培养基致P C I 2 细胞缺氧缺糖模型取处于对数增长期的P C I 2 细胞，用吸管吹打使其悬浮并成单个细胞，进行细胞计数
12、，以1 1 0 5 几个细胞密度接种于9 6 孔培养板中，每孔l0 0uL 。分四组，每组5 个复孔，置于3 7 。C ，5 C 0 2 饱和湿度的C 0 2 培养箱中，2 4 小时后加入含连二亚硫酸钠的无血清培养基，使各组终浓度为1 0 m m o l L ( 高剂量组) ，5 m m o l L ( 中剂量组) ，1 m m o l L ( 低剂量组) ，O m m o l L ( 正常对照组) 。作用3 小时后，弃去培养基，换为无血清培养基继续培养，进行以下实验。2 3 丁苯肽作用于缺氧损伤的P C I 2 细胞 按上述步骤将P C I 2 细胞以1 0 纠札的密度，接种于9 6 空板(
13、 1 0 0 此) ，分6 组，正常对照组，缺氧模型组和药物干预组( 低、中、高剂量组) ，每组5 个复孔，置于3 7 。C ，5 C 0 2 ，饱和湿度的C 0 2 培养箱中。培养2 4 小时后，药物干预组分别加入2 0um o l L ，1 0um o l L ，1um 0 1 L 丁苯肽，预作用6 小时后，模型组和药物组分别加入终浓度5 m m o l L 的连二亚硫酸钠，作用3 小时后，弃去培养基，加入无血清培养基继续培养，进行以下实验。2 4M T T 代谢率测定培养18 小时后，进行M T T 实验，每孔加入M T T ( 5g L ) 溶液2 0uL ，3 7 孵育4h ，吸弃上
14、述溶液后，加1 5 0ul D M S 0 ，振荡1 0 分钟，酶标仪上5 7 0 n m 处测定O D 值。所得数据以均数标准差( ；s ) 表示，使用S P S S l7 O 统计软件进行统计分析，组间比较采用t 检验，以P研究论文 O 0 5 为差异有统计意义。2 5 双向凝胶电泳( 2 D E )对模型组、药物干预组进行双向凝胶电泳分析。1 、第一向等电聚焦电泳：主要参照I P G h o r T M 等电聚焦系统中的操作指南和G 6 唱掣9 】的方法进行。脑蛋白沉淀( 约1 m g ) 以水化液( 尿素8 m o l L + 2 ( w v ) C H A P S + O 5 ( v
15、 v ) I P GB u 仃e r ) 充分溶解后，并于以下程序于2 0 自动进行泡胀和聚焦。泡胀1 2h 后，其间给予低电压3 0V ；5 0 0v ，持续1h ；1o o Ov ，持续1h ；5 0 0 0v ，持续1h ；8 0 0 0v ，持续2h 。2 、平衡：等电聚焦结束之后，迅速将I P G 胶条取出，在1 0m l 平衡液I ( 5 0m m o l L 啊s H C lp H 8 8 ，3 0 甘油，6m o l L 尿素，l D T T ，2 S D S ，痕量溴酚蓝) 中平衡1 5m i n ，然后放置于1 0m l 平衡液I I ( 5 0m m o l L 确s H C lp H 8 8 ，3 0 甘
