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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 孙俊杰， 莫家骢， 马 毅， 何晓顺 作者单位：1. 广州市儿童医院普通外科， 广东 广州 510120; 2. 中山大学附属第一医院小儿外科， 广东 广州 510080;3. 中山大学附属第一医院器官移植科， 广东 广州 510080【摘要】 【目的】 探讨大蒜素对神经母细胞瘤生长的影响及相关机制。 【方法】 MTT 法测定不同浓度大蒜素对神经母细胞瘤细胞生长的影响;建立裸鼠人神经母细胞瘤皮下移植瘤模型 24 只(n = 8)，随机分为对照组、大蒜素组(1 mgkg-1d-1)和大蒜素组(10 mgkg-1d-1)，观察其对肿瘤生长的影响，荧光定量
2、PCR 法测定大蒜素对裸鼠皮下移植瘤 VEGF mRNA 表达的影响;ELISA 法测定裸鼠血浆 VEGF 浓度;免疫组化法观察肿瘤微血管密度。 【结果】 不同浓度的大蒜素均能抑制神经母细胞瘤细胞的生长，高浓度的大蒜素能直接杀死肿瘤细胞;大剂量和小剂量大蒜素对裸鼠神经母细胞瘤皮下移植瘤均有抑制作用。对照组、大蒜素组和组的肿瘤体积为(2143 127) mm3、(1041 89) mm3 和(904 65) mm3 (P 8 个红细胞面积的血管排除在外。微血管密度(MVD)为平均微血管数目/0.216，本过程按盲法操作。1.7 统计学方法数据用均数标准差(x s)表示，采用 t 检验和方差分析。
3、采用 SPSS 11.0 软件包，取?琢 = 0.05。2 结 果2.1 倒置相差显微镜下 SK-N-SH 细胞形态观察KKME-专业医学搜索引擎 http:/ SK-N-SH 细胞呈梭形或多角形，有较长的突起，呈单层贴壁，生长迅速，代谢旺盛，48 h 须换液一次，3 4 d 传代 1 次。对照组细胞大小、形态不规则，但差异不大，折光性好，边缘清晰，内含丰富颗粒。药物处理组 12 h 后细胞大小、形态和贴壁能力较对照组有明显差别：低浓度大蒜素组(10、20 g/L)作用后，细胞形态变化不大，贴壁尚可;较高浓度大蒜素组(40 g/L)作用后，细胞明显皱缩，突起少见，细胞间隙增大，细胞内颗粒颜色加
4、深，折光性增强，大量细胞呈片状脱落，培养液中有多量细胞漂浮，细胞生长明显减缓。处理 24 h 后上述变化更加明显。高浓度大蒜素组(400、4 000 g/L)作用 12 h 后，绝大部分肿瘤细胞死亡(图1A、B)。2.2 大蒜素对人神经母细胞瘤 SK-N-SH 细胞生长的影响MTT 法结果显示不同浓度的大蒜素对人神经母细胞均有抑制作用，与对照组比较，差异有统计学意义(P 0.05);高浓度的大蒜素可直接杀死神经母细胞(表 1)。2.3 裸鼠皮下移植瘤成瘤率及大蒜素的影响24 只裸鼠全部成瘤，成瘤率 100%。SK-N-SH 细胞接种后1 周左右成瘤。各组裸鼠实验期间，精神、反应和饮食正常，实验
5、结束时，24 只裸鼠均存活，无裸鼠死亡退出实验，对照组裸鼠肿瘤表面有明显出血和坏死，血管丰富。与对照组比较，不同剂量的大蒜素能明显抑制皮下移植瘤的生长，肿瘤的重量和体积差异有统计学意义(P 0.05);小剂量组与大剂量组间比较，差异有统计学意义(P KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 0.05;表 2，图 2)。2.4 大蒜素对裸鼠人神经母细胞瘤 VEGF mRNA 转录和翻译的影响与对照组比较，不同剂量的大蒜素均明显抑制肿瘤 VEGF mRNA 的转录，抑制肿瘤 VEGF 的分泌(P 0.05)，不同浓度组间比较差异有统计学意义(P 0.05，表 2)。2.5 大蒜素对裸鼠人神经母细胞
6、瘤皮下移植瘤 MVD 的影响与对照组比较，不同剂量的大蒜素均明显减少神经母细胞瘤 MVD(P 0.05)，且不同浓度组间比较差异有统计学意义(P 0.05，表 2)。3 讨 论神经母细胞瘤(NB)为小儿最常见的颅外实体肿瘤，其恶性程度高，早期即可发生多部位、多系统转移，手术切除率低1。NB对常规放射和化学治疗不甚敏感，患儿的预后不理想，其发病率和病死率居儿童肿瘤前列，严重威胁广大儿童的生命健康1。有必要寻求一种新的、安全有效的 NB 治疗药物，以期改善 NB 的治疗效果和预后。目前关于大蒜素和 NB 关系的研究尚未见报道，我们选取大蒜素为研究药物，采用体外细胞培养和裸鼠实验的方法，观察大蒜素对
7、 SK-N-SH 细胞生长的影响，并探讨其在细胞、蛋白、基因等多个水平上可能的作用机制，以期为 NB 的防治做一有益的探索。大蒜素为大蒜鳞茎中提取的特有的含硫化合物，近年国内KKME-专业医学搜索引擎 http:/ SK-N-SH 细胞形态和细胞增殖有明显影响，10 g/L 大蒜素即可抑制 SK-N-SH细胞增殖，并且这种抑制作用，随药物浓度的增加而加强，400 g /L 以上大蒜素作用 48 h 可直接杀死肿瘤细胞。在进一步的裸鼠实验中我们发现，不同剂量的大蒜素均能抑制裸鼠人神经母细胞瘤皮下移植瘤的生长，大蒜素处理后的裸鼠皮下移植瘤的体积和质量明显小于对照组，呈剂量-效应关系。肿瘤的生长必须
8、依赖血管形成，在缺乏血管新生的条件下肿瘤仅能生长2 3 mm。VEGF 是目前所知作用最强的促血管生长因子，诱导内皮细胞有丝分裂，增加血管通透性，抑制肿瘤细胞的凋亡，并能通过诱导巨噬细胞释放血管生长因子，间接促进血管生成。VEGF对肿瘤的生长、浸润和转移均发挥重要的调节作用，与肿瘤的临床分期呈正相关关系9。实验证实 NB 皮下移植瘤中 VEGF 呈高表达10，NB 患者肿瘤组织的 VEGF mRNA 亦呈高表达，肿瘤组织表达VEGF 的高低与肿瘤分级有关11。本实验中我们运用荧光定量PCR 和 ELISA 的方法，定量检测裸鼠皮下 NB 的 VEGF mRNA 的转录量和血清 VEGF 的浓度
9、，证实运用大蒜素后能够下调 NB 的转录和翻译，从而抑制 NB 生长。肿瘤的生长、转移和新生血管的数量有密切关系，NB 中VEGF 和 MVD 均呈高表达12，VEGF 与肿瘤内 MVD 呈正相关关系9。有学者认为 MVD 是评价肿瘤组织内血管生成状态以及判断KKME-专业医学搜索引擎 http:/ CD34 单克隆抗体及盲法计算裸鼠皮下移植瘤标本的 MVD，结果提示大蒜素可以降低人神经母细胞瘤移植瘤的 MVD，显示出具有抗肿瘤血管生成的作用。该结果与肿瘤 VEGF mRNA 的定量分析和外周血 VEGF 浓度测定结果一致。上述研究表明，大蒜素对神经母细胞瘤有明显的抑制作用，作用靶点为抑制肿瘤
10、 VEGF 的表达，为我们治疗 NB 提供了一个新的可能，但要想使其真正应用于临床并使 NB 患儿受益，还需要开展更广泛更深入的研究。【参考文献】1檀卫平，见须英雄，马渊理. 神经母细胞瘤 60 例预后因素分析 J. 中山大学学报：医学科学版， 2003，24(1)：92-96.2郑 磊，孙晓非，甄子俊，等. 神经母细胞瘤患者血清神经元特异性烯醇化酶水平变化的临床意义附 50 例报告 J. 新医学， 2008，39(10)：644-646.3朱明亮，朱云发. 颅鼻沟通嗅神经母细胞瘤 1 例及文献复习 J. 中华神经医学杂志， 2003，2(3)：229-230.4Kwon KB， Yoo SJ
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