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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 璇，高 玉，韩 燕， 宁启兰，张富军，宋天保，吕社民 作者单位：西安交通大学医学院：1. 遗传学与分子生物学系，陕西西安 710061;2. 第二附属医院临硕 42 班，陕西西安 710004;3. 人体解剖学与组织胚胎学系，陕西西安 710061【摘要】 目的 建立大鼠肝脏干细胞的 Pdx1 基因表达系。方法 逆行穿刺 SD 大鼠乳鼠肝脏门静脉，经胶原酶消化并分离肝脏干细胞;免疫组织化学鉴定大鼠肝脏干细胞标志物细胞角蛋白18/19、甲胎蛋白的表达;构建 pEGFPPdx1 表达载体并酶切鉴定，用脂质体 2000 介导表达载体转染大鼠肝脏干细胞后，荧光
2、显微镜观察 GFP 表达，免疫组织化学鉴定 Pdx1 的表达。结果 肝脏门静脉逆行穿刺分离培养大鼠肝脏干细胞具有分裂增殖能力、角蛋白18/19、甲胎蛋白表达阳性;pEGFPPdx1 表达载体转染后的肝脏干细胞可表达绿色荧光蛋白报告基因和 Pdx1 蛋白。结论 成功建立了大鼠肝脏干细胞 Pdx1 表达系。【关键词】 大鼠;肝脏干细胞;胰腺十二指肠同源盒;表达载体expressing pancreatic duodenal homeoboxREN Wuchao1#, LI Dongmin1#, WANG Xuan2, GAO Yu2, HAN Yan1,NING Qilan1, ZHANG Fuj
3、un1, SONG Tianbao3, L KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Genetics and Molecular Biology Department, Medical School of Xian Jiaotong University,Xian 710061; 2. the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University,Xian 710004; 3. Human Anatomy and HistologyEmbryology Department, Medical School
4、ofXian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To establish a liver stem cell line expressing pancreatic duodenal homeobox (Pdx1) in rats. Methods Rat liver stem cells were obtained by digestion of collagenase IV and isolation after hepatic portal vein puncture. The liver stem ce
5、lls were identified by using specific antibodies against cytokeratin 18 and 19 and AFP. The stem cells were transfected with pEGFPPdx1 expressing vector using liposome 2000, and Pdx1 exprssion was identified by observing green fluorescence protein expression under the microscope and by using immunoh
6、istological staining. Results Rat liver stem cells isolated and cultured through hepatic portal vein puncture were capable of mitosis and proliferation, and could also express cytokeratin 18 and 19 and AFP, suggesting that they are indeed liver stem cells. Pdx1 gene transfected cells can express gre
7、en fluorescent protein reporter gene and Pdx1 protein. Conclusion A Pdx1 expressed rat liver stem cell line KKME-专业医学搜索引擎 http:/ been successfully established.KEY WORDS: rat; liver stem cell; pancreatic duodenal homeobox (Pdx1); expression vector1 型糖尿病是严重危害人类健康的代谢性疾病。建立内源性胰岛分泌系统,包括胰腺移植、胰岛移植等对于 1 型糖尿
8、患者来说是重要的治疗手段。但是，伦理和免疫排异反应使其应用受到限制。近年来，人工诱导干细胞向能够分泌胰岛素的细胞进行分化，为胰岛移植提供了全新的细胞来源1。肝脏和胰腺来自胚胎内胚层的同一个细胞群，进化上具有相似性。肝脏干细胞可能具有在一定条件下转化为具有胰岛特征的胰岛素分泌细胞的能力2。胰十二指肠同源盒(pancreatic duodenal homeobox, Pdx1)蛋白是胰岛内分泌细胞群发育、分化与成熟的主要调控蛋白3。小鼠体内的 Pdx1 基因的沉默和敲除可致胰腺发生缺失45。已经有研究证明 Pdx1 在成体干细胞中的异位表达可实现成体干细胞向胰腺细胞的分化。但是，对于肝脏干细胞的研
9、究尚无详实报道。我们成功从大鼠乳鼠肝脏中分离出肝脏干细胞，并且用从胰腺中分离出的 Pdx1 基因成功转染这种细胞，为研究肝脏干细胞向胰岛样细胞的体外定向分化奠定了实验基础。1 材料与方法1.1 实验动物 出生后 13d 的 SD 大鼠新生乳鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。1.2 仪器与主要试剂 蛋白核酸定量仪型号为 CE231，购KKME-专业医学搜索引擎 http:/ GENEGUEST;荧光倒置显微镜购于 OLYMPUS，凝胶成像系统购于 SYNGENE;PCR 热循环仪(PTC100 BIORAD)抗大鼠 CK18抗体、抗大鼠 CK19抗体、抗大鼠 Pdx1 抗体、抗大鼠 AF
10、P 抗体购于 Chemicon 公司;Trizol 及 Lipofactamine 2000 购于 Invitrogen 公司;胎牛血清 及 DMEM 培养基购于 Hyclone 公司;型胶原酶购于Sigma 公司;抗兔Cy3 二抗免疫荧光试剂盒，抗小鼠FITC 二抗免疫荧光试剂盒购于北京中杉公司;引物由 Augct Biotechnology 公司合成。1.3 真核表达载体 pEGFPPdx1 的酶切鉴定 用PrimerPrimier 5.0 设计 Pdx1 基因的引物，序列是：上游引物5CCCAAGCTTATGAATAGTGAGGAGCAGTACTACG3，下游引物 5CCGGATCCTC
11、ATCACCGGGGTTCCTGC3。利用 TRIzol 提取胰岛总 RNA，RTPCR 法扩增目的基因 Pdx1，用限制性内切酶 BamH和 Hind分别双酶切 Pdx1 和真核表达载体 pEGFPN1，凝胶回收试剂盒纯化酶切片断，T4DNA 连接酶连接，转化感受态大肠杆菌 DH5。挑选阳性克隆，质粒小量制备试剂盒提取质粒，用 BamH和 Hind双酶切鉴定重组载体，并对克隆的目的片段送奥科公司测序。1.4 大鼠肝脏干细胞分离鉴定1.4.1 穿刺大鼠乳鼠肝脏门静脉进行灌注 取新生 SD 大鼠2 只，断颈处死，750mL/L 乙醇内浸泡 5min 消毒。玻璃微电极(玻璃拉针器制备)套入头皮针塑
12、料管，连接于充有 PBS 缓冲液的 20mLKKME-专业医学搜索引擎 http:/ PBS 缓冲液，穿刺成功后剪断下腔静脉，持续推注 PBS 直到肝脏由红色转变为淡黄色。1.4.2 肝脏干细胞原代培养 取经门静脉灌注后的肝脏，置于冰上，用眼科镊子分离，弃去肝脏被膜和结缔组织，加入型胶原酶 1mL，37消化 5min，PBS 溶液终止消化，200 目滤网过滤，滤液 1100r/min 离心 5min。PBS 缓冲液洗涤 2 次(1100r/min 离心5min)，含 100mL/L FBS 的低糖 DMEM 培养基重悬细胞，接种于25cm2 培养瓶内 37、50mL/L CO2 培养。24h
13、后加入等量新鲜培养基。48h 后小心吸出培养基，原瓶内加入新鲜培养基。注意观察细胞生长情况，每 24h 更换一次培养基6。1.4.3 大鼠肝脏干细胞的鉴定 细胞免疫荧光法鉴定细胞角蛋白 18、细胞角蛋白 19 的表达。取出有细胞爬片的细胞培养皿，移液器吸出所有培养基，将 PBS 缓冲液滴加在玻片上，清洗 3 次。多聚甲醛溶液滴加入培养皿，固定 1h。从多聚甲醛中取出玻片，放置于载玻片上。PBS 洗 5min。用稀释的正常血清封闭，孵育20min。吸去封闭血清，分别加 1500 稀释的细胞角蛋白 18、细胞角蛋白 19 抗体，孵育过夜后，用 PBS 洗 5min。加 FICT 标记的第二抗体，孵
14、育 30min。用 PBS 水洗 5min 后，甘油封闭。正置荧光显微镜观察、照像。DAB 法染色测定 AFP 蛋白的表达。多聚甲醛溶液固定细胞后，用 PBS 洗 5min。滴加 300mL/L 双氧水，孵育20min。胰酶修复抗原，用稀释的正常封闭血清孵育 20min。测试组KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 1100 稀释的 AFP 抗体，对照组滴加等量抗体稀释液过夜，37孵育过夜。PBS 洗 5min，对照和测试组均滴加配置好的 DAB显色剂，37孵育 30min。PBS 水洗 5min。中性树胶封闭。显微镜观察、照像。1.5 Pdx1 基因转染大鼠肝脏干细胞 转染前一天消化细胞，
15、1100r/min 离心 10min，1mL 培养基重悬细胞，用血细胞计数板计数细胞，约 6105 细胞培养到 6 孔板内，此日细胞达到约 80%交汇。更换培养基，每孔加入 2mL 新鲜含血清和抗生素的培养基。在一洁净无菌离心管内依次加入 4L Lipofecter、2.0g DNA，加入不含抗生素和 glutamine 的 DMEM 溶液，终体积为 70L，轻轻吹打混匀。1525孵育 15min 把 70L LipofecterDNA 混合物分别加入六孔板的各孔内，轻轻混匀。细胞培养箱内培养 6h 后，吸除含有LipofecterDNA 的培养液。每孔加入 2mL 新鲜细胞培养基继续培养。1.6 Pdx1 基因表达的检测 取出有细胞爬片的细胞培养皿，移液器吸出所有培养基，将 PBS 缓冲液滴加在玻片上，清洗 3 次。多聚甲醛溶液滴加入培养皿，固定 1h。从多聚甲醛中取出玻片，放置于载玻片上。PBS 洗 5min。用稀释的正常封闭血清孵育 20min。吸去封闭血清，分别加 1500 稀释的 Pdx1 蛋白抗体，孵育过夜，PBS 洗 5mi
