细菌生理生化试验

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1、实验实验一一 细菌的细菌的单孢分离单孢分离微生物的形态结构观察微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、 细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在 形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成 的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加 以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。一：细菌的培养特征包

2、括：在固体培养基上观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、 透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。 半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 1、琼脂平皿上的生长表现观察并记录不同的菌落：大小、形状、边缘、表面性状、隆起度、颜色、透明度、硬度、 溶血等。 2、观察琼脂斜面上的生长表现：菌苔的颜色及茂盛情况。 3、观察半固体琼脂的生长现象：绒毛状、线状等。二：细菌的培养特征 1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐13.波

3、状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假 根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状实验实验二二 细菌的生理生化试验细菌的生理生化试验实验九 细菌的生理生化试验 1 目的 1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理 1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法 2 原理 各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异

4、就表现的 更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相 同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生 理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。 3 材料 3.1 菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes） 、普通变形杆菌（Proteus vulga ris） 、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种 3.2 培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖） 3.3 试剂

5、：40NaOH 溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。 3.4 器具：超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。 4 流程：糖发酵试验V-P 试验甲基红试验吲哚试验 5 步骤 (一) 糖类发酵试验 1 目的：了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法 2 原理:可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发 酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即 B.C.P 指示剂，其 pH 在 5.2 以下呈黄色，pH 在 6.8 以上呈紫色） ，经 培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放

6、入倒置杜氏小管观察。 3 材料 3.2 菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes） 、普通变形杆菌（Proteus vulga ris）的斜面菌种 3. 培养基 葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管 流程 发酵液试管标记接种培养观察记录 5 步骤 5.1 试管标记 图 9-1 糖发酵产气 取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各 不产气； 产气 4 支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。 5.2 接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌

7、。将装有培养 液的杜氏小管倒置放入试管中（图 9-1） ，置 37恒温箱中培养，分别在培养 24h、48h、和 72h 观察结果 。 5.3 观察记录 与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“ ”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“”表示。培养液中 的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“”表示；如杜氏小管内没有 气泡为阴性反应，记录用“”表示。 （二） 乙酰甲基甲醇试验(VP 试验) 1 目的 了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法 2 原理 某些细菌在

8、葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者 在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称 VP（+）反 应。 3 材料 3.1 菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes） 、普通变形杆菌（Proteus vulga ris） 、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种 3.2 培养基 葡萄糖蛋白胨培养液的试管 流程 培养液试管标记接种培养观察记录 5 步骤 5.1 标记试管 取 5 支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠

9、杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和 空白对照。 5.2 接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置 37恒温箱中，培养 2448h。 5.3 观察记录 取出以上试管，振荡 2min。另取 5 支空试管相应标记菌名，分别加入 35ml 以上对应管中的培养液，再 加入 40NaOH 溶液 1020 滴，并用牙签挑入约 0.51mg 微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入 ，置 37恒温箱中保温 1530min 后，若培养液呈红色，记录为 V.P.试验阳性反应（用“”表示） ；若 不呈红色，记录为 V.P.试验阴性反应（用“”表示） 。 注意：原试管中留下的

10、培养液用作甲基红试验。 （三） 甲基红试验（M.R.试验） 1 目的 了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法 2 原理 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不 同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基 PH 值下降至 pH4.5 以下，使甲基红 指示剂变红。 3 材料 3.1 菌种 同 VP 试验 3.2 培养基 同 VP 试验 4 流程 培养液指示剂观察记录结果 5 步骤 于 V.P.试验留下的培养液中，各加入 23 滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培 养液上层变成红色，即为阳性

11、反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“”或“”表示。 （四）吲哚试验 1 目的 掌握吲哚试验(Ehrlich 法)的原理和方法 2 原理 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见， 但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。 3 材料 3.1 菌种 测试菌株 3.2 培养基 蛋白胨水培养基 3.3 试剂 二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。 4 流程 标记试管接种培养观察记录 5 步骤 5.1 试管标记 取装有蛋白胨水培养液的试管 5 支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白 对照。 5.2 接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第 5 管作空白对照不接种，置 37恒温箱中培养 244 8h。 5.3 观察记录 在培养液中加入乙醚 12ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此 时沿管壁缓慢加入 510 滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察） ，如 有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“” 、阴性用“ ”表示。 6 结果 记录生理生化反应测定结果