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1、 从异源表达的环境 DNA 中分离长链的 N-酰基氨基酸Sean F. Brady and Jon Clardy*化学与化学生物系纽约 伊萨卡 康奈尔大学 14853-13012000 年 8 月 11容易被标准培养技术培养的极少数的土壤微生物,大约有 0.1至 1.0,创了一批阵容强大的生物活性物质,而未被培养的绝大多数可能产生具有化学多样性和生物活性的自然物质,就像被培养的微生物一样,要增加生产天然物质的未培养微生物,从土壤样品中直接提取的粘粒库 DNA(环境 DNA,eDNA)被用于构造和筛选具有生物活性的小分子物质。一个活性的粘粒克隆体，CSL12，产生了一系列长链的 N-酰基-L-酪
2、氨酸抗生素。长链的N-酰基氨基酸是生物合成基因尚未得到的确定的正在发展的细菌族群，CSL12 克隆的 eDNA 的分析表明一个单一的开放阅读框（ORF）负责这些抗生素的生产，从而导致对我们相信是第一个长链的 N-酰基氨基酸生物合成基因的鉴定。在这种沟通中，我们报告了这些新的天然产物抗生素的性状和一种长链的 N-酰基氨基酸合酶的结构序列。连续的两种抗生素的选择方案是用来区分然后恢复生产抗菌粘粒克隆的活动。粘粒 eDNA 库是在在含卡那霉素的 LB 平板最初选择的，并允许在 30C 下培育 2-4 天。成熟的菌落随后叠加在含枯草芽孢杆菌抗性的卡那霉素的顶级琼脂。在 30C经过了一个 24 小时的潜
3、伏期后，在枯草杆菌区域产生生长抑制作用的菌落,说明了抗菌活性的产生,并通过追踪含氨苄青霉素（50 微克/毫升）的 LB 板上的细菌来得到恢复.第二个选择, 在氨苄青霉素上，除去枯草芽孢杆菌检测应变，并允许抗菌直接从实验板中复苏。约 700000 克隆筛选中，65 个抗菌中活性被发现。因为我们是最感兴趣的是小分子抗生素，从活性克隆体的小规模培养菌中提取的乙酸乙酯被用于抗菌活性的检测. 其中的一个克隆，产生了具有相当活性的有机提取物，CSL12，被选作进一步鉴定。当从 CSL12 中纯化得到的质粒被转入大肠杆菌时，它继续赋予抗菌活性表明了 eDNA 与观测到的活性有关。从 CSL12 生物中提取的
4、乙酸乙酯中的活性物质,使用抗枯草芽孢杆菌的生物活性制剂通分馏分离, 粗乙酸乙酯提取物取自生长在 LB（30 微克/毫升，卡那霉素）的中性生物,30 摄氏度下培养 60 小时. 乙酸乙酯提取物通过正常的分区相闪光色谱(氯仿：甲醇与 0.1醋酸梯度变化) 和活性物质，从硅胶洗脱反相的 LC-CN 柱，然后再分区闪光色谱法（乙腈：水与 0.1三乙胺梯度变化） 。十三种相关的化合物俗名为 CSL12-A 通过CSL12-M 的反相分离高效液相色谱法从第二次色谱柱抗菌活性物质的洗脱. 从乙酸乙酯活性物质提取了 3.5 KB BAMH CSL12的亚克隆，CSL12.1 产生相同的相位反相高效液相色谱法的
5、痕迹, 这亚克隆用于其余的表征研究。CSL12-A 的质量频谱分析是通过 CSL12-M 表明他们是一个家族的酪氨酸长链饱和及不饱和酰基衍生物，113. 酪氨酸明显是从观察的 LRESI 质谱碎片（m / z 为 182 和 136）和从高分辨率质谱推测出的（见表 1）酰基侧链。化合物 1-13 在茚三酮显色法下均显示阴性表明酰基取代基通过酰胺键与氮相连。12904 J. Am. Chem. Soc., Vol. 122, No. 51, 2000 图 1：基因组启动系统（GPS）转座子诱变 CSL12.1。转座子插入淘汰，减少或不影响抗菌活性；CSL12.1 生产标有红色，黄色或绿色标志，分
6、别为：(a) 从 CSL12 插入 13.5 kb (b) 含有 ORF1 基因的预测启动的扩大区域(c) 在酪氨酸上拟议的符合相应的 eDNA 核糖体结合位点（RBS） ，-35 和-10 共识序列的大肠杆菌。N-酰基酪氨酸的结构和配置，在这一系列的化合物中酪氨酸最终被证实由全合成生成的两个代表性的例子：-C 的 CSL12（3） ，最丰富的化合物从 CSL12.1 分离，CSL12 - G（7） ，从 CSL12.1.5 两个 3 和 7 隔离最活跃的化合物之一是光谱相同，其N-癸合成同行-L-酪氨酸和 N-豆蔻-L-酪氨酸。N-酰基酪氨酸 的结构和配置,在这一系列的化合物酪氨酸最终被 证
7、实由醛合成的两个代表性的例子:-C 的 CSL12 (3), 最丰富的化合物 CSL12.1 分离, CSL12 - G (7), 从 CSL12.1.5 两个 3 和 7 提取最活跃的化合物 之一是光谱相同, q N 癸合成同行 -L-酪氨酸和 N-豆蔻-L-酪氨酸, CSL12-CSL12-M 型（1-13）显示出不同程度的抗菌活性，酪氨酸长度显著影响这些天然产物的抗菌活性与脂肪替代。在对枯草杆菌检测中，C13 至 C16 的饱和和不饱和 N-酰基取代 L - 酪氨酸是最活跃的。侧链和两个碳或长或短的酪氨酸衍生工具明显不活跃，甚至更短的侧链衍生物，基本上是无活性的的。CSL12.1 基因系
8、统的组转座子突变插入（New England Biolabs公司，马萨诸塞州）表明，测序一个单一的开放骨架（ORF1 基因）的产生所观测到的抗菌活性，并允许 CSL12.1 插入，有两个例外：已发现的转座子插入淘汰生产抗菌活性的 ORF1 （图 1A） ，剩下的是两个插入 ORF1 基因的 eDNA 中的内源性启动子（图 1B）除了座子完全淘汰的抗菌活性，我们还发现了一个影响启动子上端和下端，但在 ORF1 基因组插入后在琼脂平板实验中观察到的抗菌活性降低（图1b） 。转座子插入的研究表明，ORF1 基因的 eDNA 包含它自己的启动成功用于大肠杆菌的抗菌活性和负责的。在体外生化研究目前正在进
9、行确认的 ORF1 是一个 N-酰基转移和不能正常间接导致酪氨酸 N-酰基化合物在大肠杆菌中宿主的生产。增设 3 个假想的的 ORF（150 个氨基酸） ，目前在 CSL12.1 似乎并没有被组织为次生代谢产物基因簇，A BLAST 的研究没有发现任何与这些 ORFs 的序列相似性沉积序列。A BLAST 的研究从甲烷jannaschii，8（MJ1207）类似的 ORF1 中发现一个序列，一个假设的蛋白质， 。 并假设其中的 MJ1207 的 N-酰基转移，并认为尽管ORF1 基因是这组序列的同源性唯一的远亲，其功能类似于转移 N-酰基，生产的 N-酰基产品可能具有显着的同源性序列。长链的
10、N-酰基 aminoacylases 已在细菌，微生物之中被广泛的鉴别出，然而这些化合物还尚未经过酶的催化测定，这种天然产品日益增长的家庭的作用仍不清楚。通过观察，这些长链的 N-酰基氨基酸具有抗菌性质，很可能是长链的 N-酰基氨基酸取代了了一般类微生物的抗生素所发挥的作用。ORF1 基因的 N-酰基氨基酸的生物合成基因的特性决定了这个天然的生活产品的真正作用，以及帮助区分细菌和古细菌的测序项目中 N-酰基的其他假设的功能。未培养微生物的异源表达的 eDNA 的化学多样性：通过 CSL12-M的 CSL12-A 型（1-13）是第一种从环境 DNA.11 的异源表达的具有异源表达特点的新的天然
11、的生物活性产物，接近于自然与生物活性两者产物的生物合成基因的结合体。在这种情况下，自 CLS12 克隆而来的 eDNA 的表征表现为长链的 N-酰基氨基酸的生物合成基因。成为构建和筛选大量的 eDNA 库的，上述方法是随时获得许多以前无法进入的微生物产生的天然产物的简便方法。这种方法也可用于替代目前普遍使用的粘粒穿梭载体异源表达法。感谢：感谢 Jo Handelsman 和 Robert Goodman 的深入研究。来自 Mass Spectrometry Facility 的 Mass Spectrometry 基金，美国康奈尔大学化学与化学生物学系。这项工作是由美国国立卫生研究院（CA24
12、487）和 David Goebel B. M.; Pace, N. R. J. 细菌学 1998, 180,4765. Bintrim, S. B.; Donohue, T. J.; Handelsman, J.; Roberts, G. P.;Goodman, R. M.的进程. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997, 94, 277. Stackebrandt,大肠杆菌, W.; Goebel, B. M. FASEB J. 1993, 7, 232. Liesack, W.;Stackebrandt, E. J. Bacteriol. 1992, 174, 5072
13、. Torsvik, V.; Goksoyr, J.; Daae,F. L. Appl. EnViron. Microbiol. 1990, 56, 782. Ward, D. M.; Weller, R.;Bateson, M. M. Nature 1990, 345, 63.(2) Handelsman, J.;研究 Rondon, 兆焦耳.; Brady, S. F.; Clardy, J.; Goodman, R.M. Chem. Biol. 1998, 5, R245.(3) 粘粒库的建设: A 1:1 (w:v) 混合土和裂解缓冲液 (Zhou, J.; Bruns, M. A.;
14、 Tiedge, JM 应用与环境微生物。1996, 62, 316-322.) 在 70 摄氏度下加热两小时并且一次提取等量氯仿 a 然后 the eDNA 被 2 - 丙醇（0.6 体积）从离心机澄清水相中沉淀. 原油的eDNA 被 0.7琼脂糖凝胶电泳（100 V 为 1 小时 20 V 的 24 h）纯化和超高分子量（高分子量）的 DNA 收集电洗脱（100 伏，3 _ 30 分钟） 。纯化的 eDNA 被 BamH和小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化之前的SuperCos 载体（Sratagene）部分消化. 在 SuperCos I 载体中被捆绑在 BAMH 网络上的 DNA 随后打包成 G
15、igapack 三金包装提取物（Stratagene 公司） ，并转化进入大肠杆菌 XL1 细胞。（4）色谱条件：ODP50，10 毫米_ 25 厘米，4 毫升/分钟，CH3CN：0.1H2O 的比例为 10:90 到 40:60 与三乙胺超过 30 分钟。（5）取取适量的的酸性氯化物，加入 1 毫升的 DMF 与 L-酪氨酸 20毫克于室温下搅拌。反应 3 小时。产品 1 N 加入盐酸 10 毫升稀释后，用乙酸乙酯提取 3，合成 N-酰基酪氨酸反相，进行高效液相色谱纯化。（6）CSL12.1 核苷酸已存入 GenBank，档案号 AF324335。（7）WU-BLAST（华盛顿大学）2.0。
16、（8）Bult，C. J.等。Sciece 1996，272，1058。（9) Fukada, H.; Iwade, S.; Kimura, A. J. Biochem. 1982, 91, 1734. Shintani,Y.; Fukuda, H.; Okamoto, N.; Murata, K.; Kumura, A. J. Biochem. 1984, 96,6343. Matsumoto, J.; Nagai, S. J. Biochem. 1972, 72, 269.(10) Pohnert, G.; Jung, V.; Haukioja, E.; Lempa, K.; Boland, W.Tetrahedron 1999, 55, 11275. Alborn, H. T.; Turlings, T. C. J.; Jones, T. H.;Stenhagen, G.; Loughrin, J. H.; Tumlinson, J. H. Science 1997, 276, 945.Yagi, H.; Corzo, G.; Nakahara,
