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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ DNA 的转化的转化目的基因和载体 DNA 在体外重组后，必须重新引入活细胞内才能进行增殖。外源 DNA 引入寄主细胞的过程一般称为转化。在正常生长条件下，大多数细菌并不发生转化作用。Mandel 等人发现，细菌细胞经过氯化钙处理之后，可促进 噬菌体的转染作用。Cohen 等人后来证明，Ca2+同样可以介导质粒 DNA 对细菌细胞的转化。这是由于宿主菌经过 CaCl2 处理后，使宿主细胞诱导产生了一种短暂的“感受态” ，在此期间它们能够摄取各种外源 DNA。以后，建立了这一基本技术的很多改进方案，但所有这些方案都旨在最大限度地提高用质粒转化不同的细菌菌
2、株的效率。按 Nandel 方案处理细菌，每微克超螺旋质粒 DNA 可得到 105106 个转化菌落。若使用经过改进的大肠杆菌菌株，并且用 DMSO，还原剂和氯化六氨合高钴处理细菌，转化效率可提高 1001000 倍。这些试剂的作用机制尚不清楚。至于转化率的提高，则是经验性实验结果。在大多数情况下，用简单的 CaCl2 方法制备的感受态细胞可以满足需要，每微克超螺旋质粒 DNA 可以得到将近 107 个转化菌落。一、用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞和质粒 DNA 的转化(一)试剂和材料LB 肉汤胰蛋白胨 10g/LKKME-专业医学搜索引擎 http:/ 5g/L氯化钠 5g/LpH 7.
3、5平板培养基胰蛋白胨 10g/L酵母浸膏 5g/L氯化钠 5g/L琼脂 15g/LpH 7.5顶琼脂培养基胰蛋白胨 10g/L酵母浸膏 5g/L氯化钠 5g/L琼脂 10g/L氯化钙溶液 80mmol/L(二)操作步骤1.将受体菌种在平板培养基上划线，37过夜，进行活化。2.挑选单菌落，接入 5mlLB 肉汤，37震荡过夜。3.从上述培养产物中取 0.5ml，转入 50mlLB 肉汤，37震荡培养 24 小时，到细菌密度大约为 5107/ml。为得到有效转化，活细胞数不应超过 103 细胞/ml，可每隔 2030 分钟测量 OD260 值以监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，OD260 值
4、和每毫升中KKME-专业医学搜索引擎 http:/ OD260 值，并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的 LB 琼脂平皿以计算每一时相的活细胞，从而使分光光度读数得到标化。切记：下述所有步骤均需无菌操作。4.在水浴将菌液冷却 10 分钟，然后于 4下 3，500r/min 离心15 分钟，倾去上清液。5.用 25ml 预先冰冷的高压灭菌氯化钙溶液(80mmol/L)重新悬浮细胞。6.将细胞悬浮液在冰浴中冷 15 分钟，再于 4下 3，500r/min离心 10 分钟，倾去上清液。7.用 3ml 预先冰冷的高压灭菌氯化钙溶液(80mmol/L)分装在预先冰冷的高压灭菌 Eppendorf 离心管内
5、，每管 0.2ml，4放置1224 小时。8.加入待转化的重组质粒 DNA 溶液，和 0.2ml 菌液混匀，在冰中放置 30 分钟。实验中一定要包括下面的对照：加入已知量标准超螺旋质粒DNA 制品的感受态细胞;完全不加质粒 DNA 的感受态细胞。9.在冰浴中放置 30 分钟后，转入 42水浴中预热 1.5 分钟。10.加入 1mlLB 肉汤，于 37复壮 30 分钟到 1 小时，不用震荡。这个步骤是为了使细胞复壮和抗性基因开始表达(用于四环素筛选一般需 1 小时)。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 0.1ml、0.2ml、0.3ml 等合适的量，涂布在含抗生素的平板培养基上。涂布时可使
6、用扩散棒，也可加入顶琼脂培养基在43左右保温，取合适量的转化细胞加入 23ml 顶琼脂培养基中，混匀后，迅速倒入固体平板培养基上，使之分布均匀。12.将涂布好的平皿在室温放置 20 分钟到半小时，使菌液被固体培养吸收或顶琼脂凝固。13.将平皿放于 37培养箱中过夜，一般在 1214 小时菌落即可出现。氯化钙法是用质粒 DNA 转化细菌细胞，尤其是大肠杆菌细胞经常使用的方法。在转化时要注意以下问题：低温对 Ca2+介导DNA 的转化是必须的，氯化钙处理时一定要在低温条件下进行;用于转化的细菌细胞在对数生长期的转化能力最高，静止生长期以后，转化能力逐渐丧失。二、制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞在
7、某些情况下，例如从较难得到的样品中分离极少量的 mRNA来合成 cDNA 并构建 cDNA 的质粒文库时，需要高的转化率。简单的 CaCl2 方法不能很好的满足需要，下面介绍的方法所制备的大肠杆菌 DH1、DH5 和 MM294 感受态细胞培养物能使每微克超螺旋DNA 以5107 转化菌落的频率进行转化，但是其他大多数大肠杆菌菌株的最高转化率大约只有以上菌株的 1/101/5。一些大肠杆菌菌株(如 MC1061)不适于此法。(一)试剂KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 培养基：蛋白胨 20g酵母提取物 5gNaCl 0.5g加入 950ml 水溶解后，加入 250mmol/LKCl 溶液
8、 10ml，用NaOH 调节 pH 值到 7.0，补水到 1L，高压灭菌 20 分钟。(该溶液使用前加入 5ml 灭菌的 2mmol/LMgCl2 溶液)。SOC 培养基：将 SOB 培养基高压灭菌后，降低温度到 60以下时，加入 20ml 用 0.22m 滤膜过滤除菌的 1mol/L 葡萄糖溶液，即为 SOC 培养基。TFB 溶液的配制(1 升)：1mol/LMES(pH6.3) 10mlMnCl24H2O 8.91gCaCl22H2O 1.47gKCl 7.46g氯化六氨合高钴 0.80g1mol/LMES2-(N-吗啉代)乙磺酸的配法是：将 19.52gMES 溶于80ml 纯水中，用
9、5mol/LKOH 将溶液的 pH 值调到 6.3，然后加入纯水使终体积为 100ml。溶液用滤膜滤器(0.45m 孔径)过滤除菌，分装为 10ml 小份，于-20冻存。配制 TFB 时，在 800ml 纯水中混匀所有成分，用纯水将终体积调至 1L。溶液用滤膜滤器过滤除菌，分装成 40ml 一份，贮存于组KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 或与之相当的瓶)，存放于 4。溶液的pH 值应在 6.06.1 之间。FSB 溶液的配制(1 升)：1mol/L 乙酸钾(pH7.5) 10mlMnCl24H2O 8.91gCaCl22H2O 1.47gKCl 7.46g氯化六氨合高钴 0.80g甘油
10、 100ml将 9.82g 乙酸钾溶于 90ml 纯水制成 1mol/L 乙酸钾，然后用2mol/L 乙酸调 pH 值至 7.5，加纯水使终体积为 100ml，将溶液分装成 10ml 小份，贮存于-20。FSB 的配方：用 800ml 纯水将所有成份混合，待试剂溶解后，用 0.1mol/LHCl 调节溶液 pH 值至 6.4，如调过头，不要加碱重调，而应弃去溶液重配。用纯水将体积补至 1L。溶液用滤膜滤器(0.45m 孔径)过滤除菌，分装成 40ml 小份，装入组织培养瓶中贮存于 4。贮存期间，溶液的 pH 值可下降至 6.16.2，此后 pH 值稳定不变。DnD 溶液的配制：二硫苏糖醇(DT
11、T) 1.53gDMSO 9.0ml1mol/L 乙酸钾(pH7.5) 100mKKME-专业医学搜索引擎 http:/ 10mlDnD 溶液用可耐受有机溶剂的 MillexSR 膜(Millipore)过滤除菌，将 DnD 溶液分装成 160l 小份放入 0.5ml 的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20。DMSO 的氧化产物，据推测可能是二甲硫醚，是转化的抑制物。为避免这个问题，应购买质量最好的 DMSO。应将所购试剂分装成10ml 小份，放入无菌试管，密封管口，贮存于-70。(二)操作步骤：1.用无菌铂丝直接蘸取冻存的大肠杆菌 DH1 株(或 DH5 株，MM294 株原种)在 SO
12、B 琼脂平板表面划线，于 37培养 16 小时。(不必将冰冻的细菌融化，铂丝在冻存细菌原种的表面划过时，可带上足量的细菌，因此一管冻存细菌原种可使用多次)。2.将 45 个单菌落转移到 1ml 含 20mmol/LMgSO4 的 SOB 中，菌落直径为 12mm。中速振荡使细菌分散，然后在 1L 三角瓶中用30100ml 含 20mmol/LMgSO4 的 SOB 稀释培养物。3.于 37将细菌培养 0.53.0 小时，为达到高效转化，活细胞数务必少于 108 细胞/ml，可每隔 2030 分钟测定 OD600 值。因每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长培
13、养物在生长周期的不同时相的 OD600 值，并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的 LB 琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。4.在无菌条件下将细菌转移到一个无菌，一次性使用的，用冰KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 50ml 聚丙烯离心管中，在冰上放置 10 分钟，使培养物冷却至 0。切记：下述所有的步骤均需无菌操作。5.于 4以 4000r/min 离心 10 分钟，回收细胞。6.倒出培养液，将管倒置 1 分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。7.用约 20ml(每个 50ml 管)用冰预冷的转化缓冲液轻轻振荡，重悬沉淀(若制备需立即使用的感受态细胞可用 TFB;若
14、制备需要贮存于-70的感受态细胞则用 FSB)，将重悬细胞冰浴 10 分钟。8.于 4用 SorvallGS3 转头(或与其相当的转头)以 4000r/min 离心 10 分钟，回收细胞。9.倒出培养液，将管倒置 1 分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。10.用 4ml(每个 50ml 管)用冰预冷的 TFB 或 FSB 轻轻振荡重悬沉淀。按步骤 11-A 给出的操作程序制备立即使用的感受态细胞，而步骤 11-B 制备贮存于-70留待以后使用的感受态细胞。11.A.新鲜感受态细胞的制备：1)将 140lDnD 溶液加到每一悬液的中心，立即轻轻旋转以混匀悬液，然后在冰上放置 15 分钟。2)每管再加 140lDnD 溶液，轻轻旋转混匀，将悬液置于冰浴上，再放 15 分钟。3)将小份悬液分装到冷却的无菌聚丙烯管(100ml)中，将管置于KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 感受态细胞悬液已绰绰有余。然而，如需要更大量的转化菌落(如构建 cDNA 文库)，感受态细胞的量可能需要加大些。11-B.冻存的感受态细胞的制备：1)每 4ml 重悬细胞加 140lDMSO，轻轻旋转混匀，将悬液置冰上 15 分钟。2)每份悬液再加 140lDMSO，轻轻旋转混匀，重新放入冰浴中。3)迅速将悬液分
