《La蛋白及其突变对乙型肝炎病毒转录翻译启动和复制的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《La蛋白及其突变对乙型肝炎病毒转录翻译启动和复制的影响（122页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二军医大学博士学位论文La蛋白及其突变对乙型肝炎病毒转录翻译启动和复制的影响姓名：孙静慧申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：刘皋林;谭龙益20060501第二军医大学博士学位论文英文缩略词英文缩略词缩写英文中文L aL ap r o t e i nL a 蛋白h L aH u m a nL ap r o t e i n人L a 蛋白H B VH e o a t i t i sBv i r u s乙型肝炎病毒S L ES y s t e m i cL u p u sE r y t h e m a t o s u s系统性红斑狼疮H C VH e p a t i t i sCv i r u
2、s丙型肝炎病毒P o VP o l i ov i r u s脊髓灰质炎病毒l I I Vh u m a ni m m u n o d e f i e i e n c yv i r u s人类免疫缺陷病毒 I J Rl o n gt e r m i n a lr e p e a t长末端重复序列T A Rt r a r t s a c t i v a t i o nr e s p o n s ee l e m e m转录激活元件E M S AE l e c t r o p h o r e t i cM o b i l i t yS h i f tA s s a y电泳迁移率变动分析R R MR
3、N Ar e c o g n i t i o nm o t i fR N A 识别修饰区I R E Si n t e r n a lr i b o s o m a le n t r yr i t e内源性核糖体进入位点o R FO p e nr e a d i n gf r a m e开放读码框架R N A iR N Ai n t e r f e r e n c eR N A T 扰S i R N As m a l l i n t e r f e r e n c eR N A小干扰R N AK a n aK m a a m y c i n卡那霉素b pb a s ep a r碱基对D N Ad
4、 e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核苷酸c D N Ac o m p l e m e n t a r yD N A互补脱氧核糖核酸m R N Am e s s e n g e rR N A信使核糖核酸d N T Pd e o x y f i h o n u e l e o t i d et r i p h o s p h a t e脱氧三磷酸核苷酸D M E MD u l b e e c o SM o d i f i e dE a g l eM e d i u mD M E M 培养基I P T Gl s o p r o p y l1 3 - D
5、 t h i o g a l a e t o s i d e异丙基硫代9 - D 一半乳糖苷S D S P A G Es o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d e二烷基硫酸钠聚丙烯酰g e le l e c t r o p h e r e s i s胺凝胶电泳B C AB i c i n c h o n i n i eA e i d= 喹啉甲酸检测法第二军医大学博士学位论立中文摘要录成R N A ，形成R N A 复制中间体，再通过逆转录机制进行复制。在H B VR N A l 2 6 9 1 2 7 0 和1
6、 2 7 0 1 2 7 1 核苷酸之间分别含有R N A 酶切位点，计算机模拟H B VR N A 次级结构显示，包括R N A 酶切位点在内的H B VR N A l 2 4 3 1 3 3 3 之间9 1 个核苷酸，形成由四个茎环构成的复杂空间构象，L a 与这种空间结构相互作用，可能使H B VR N A 空间构象发生变化，掩盖R N A 酶切位点，保护H B VR N A 免受R N A 酶的降解。但L a 与H B V 的复杂作用关系仍是个未知的熏要问题。由于H B V 复制受转录和转录后双重水平及多个环节的调控，H B VR N A 转录调控和翻译启动是病毒生活周期中至关重要的环
7、节。目前有关H B V 复制的关键调控元件的准确定位及其与肝脏内多种成分的相互作用机制尚不明确。综合国内外相关研究，我们推测：野生型L a 与初生H B V R N A 结合，使R N A空间构象改变而免受R N A 酶的降解，稳定H B VR N A 含量，有助于功能性起始复合物的形成；与H B VI R E S 结合，启动R N A 的翻译，使H B V 顺利复制。当L a 发生突变后，其原有结构的改变影响与H B VI R E S 的作用，可能抑制功能性起始复合物的形成，最终抑制了H B VR N A 的翻译起始和病毒复制。改变L a 的生物学性状，干扰L a 与H B VR N A 之
8、间的相互关系，可能成为抗H B V 感染的突破点之一，已经引起诸多关注。探讨h L a 与H B V 复制的关系，对寻找新的抗H B V 药物靶点具有重要的理论和实践意义。本课题分别在体外转录翻译系统和稳定表达H B V 肝癌细胞中，拟通过研究L a及突变体对a d r 亚型H B VR N A 的结合亲和力分析、H B V 及O R F 体外转录翻译的影响，以及细胞内L a 与H B V 复制的关系，探讨L a 及其突变对H B V 转录、翻译启动、H B VR N A 稳定性、蛋白质表达和病毒复制的影响，并期望通过实验研究发现影响H B V 复制的关键因素，寻找阻断H B V 复制的新的干
9、预方法，为乙型肝炎病毒的防治提供新的策略。研究分为以下三个部分进行。第一部分人L a 蛋白及其突变体原核表达质粒的构建和诱导表达纯化本实验采用定点突变和P C R 技术，完成点突变和大片段缺失突变体表达质粒的构建，获得h L a 三个突变体D e L l ，D e L 2 ，D e L 3 真核表达质粒，并在大肠杆菌中融合表达，经亲和层析和H P L C 纯化，实现了野生型h L a 及其突变体的诱导表达和纯化，为后期实验研究打下了关键基础。4第二军医大学博士学位论文中文摘要全基因和P 基因转录有较弱的下调作用，但显著抑制了x 基因的转录( P O 0 5 ) 。h L a及突变体在伞S 基因
10、转录中未见显著性作用，但下调了X 基因转录，且D e L 2 的抑制作用最强。3 3h L a 及其突变体和R N a s eH 刈H B V g e n e 体外转录的影响33 1h L a 和R N a s eH 埘H B V g e n e 体外转录的影响根据上。步实验的结果，我们选择用H B V 全基凶的转录研究其与h L a 及核酸酶的关系，在体系中加入巧i 同量的R N a s e H 或同时介入h L a 和R N a s e H 进行转录。结果发现，加入R N a s eH 越多，R N A 越易降解。将h L a 和R N a s e H 同时加入后，R N A 降解减慢，浓
11、度也相应升高( 见图2 2 8 ) 。第二军医人学博t j 学位论文第一部分图2 2 - 8 h L a 和R N a s eH 对H B V g e n e 体外转录的影响F i g2 - 2 8 T h ee f f e c to fh L aa n dR N a s eHo nH B Vi nv i t r ot r a n s c r i p t i o nC o n t ：p G G M 真达阳性对照模板转录的R N A ；l ：H B Vl r 常转录：2 ：体系中加入1 0 1 u LR N a s e H ；3 ：体系中加入5 0 p Lh L a 和1 0 肛LR N a s
12、 e H ；4 ：体系中加入2 0 u LR N a s e H33 2h L a 及突变体与R N a s eH 对H B V 令基冈体外转录的影响为进步研究h L a 及其突变体与R N a s eH 对t t B V 全基网体外转录的影响，将h L a 及其突变体与R N a s eH 分别加入H B V 全基闪体外转录系统r f l ，紫外分光光度计测定转录的H B VR N A 产量，在相同实验条件卜重复扛次，采用t 检验和方差分析对R N A 浓度进行统计分析，比较h L a 及其突变体与R N a s eH 埘H B V 体外转录的影响。山圈2 2 9 可见，加入R N a s
13、e H 后，R N A 产量降低：加h L a 和R N a s e H 后，R N A 产量凹升( P O 0 5 ) 。h L a 和D e L l| 二凋了全S 表达的H B s A g ，但D e L 2 对全S 的册s A g 表达却出现抑制作用。而且，全长H B V 表达H B s A g 的量比P 基因和全S 基因的表达量高。对H B e A g 的表达，全长H B V 的表达量远高于全c 基因的表达。但是，h L a 降低了全C 基因的表达，而3 个突变体却促进了全长H B V 的H B e A g 表达，D e L 2 的促进作用最强。表明，第二军医大学博士学位论文第一二部分
14、突变体D e L 2 和D e L 3 对全C 基因的表达有促进作用，提示h L a 的R R M 3 和R R M 2可能对全c 基因的表达有抑制作用，有必要合成R R M 3 肽段来研究对H B e A g 的表达影响。4 讨论国外文献报道，h L a 有助于H B VR N A 的翻译启动和H B V 复制，是H B V 的转录调节因子。有报道，将h L a 的结合位点缺失后，有效地抑制了m d m 2m R N A 的表达【2 2 】。h L a 是否会在H B V 的体外表达系统5 1 铷1 中发挥作用以及h L a 和突变体在体外翻译过程中的作用如何都是我们实验关注的问题。实验中采
15、用荧光标记法对S D S P A G E 胶进行荧光扫描，虽然灵敏度不高，但比较容易确定蛋白表达的状况，即在质上作出判定，后期的电化学发光法检测是为了对蛋白表达量进行比较精确的定量分析。本研究将p C M V T N T T M H B V 、p C M V T N T r ”- 全S 和p C M V T N T r ”- 全C 分别作为体外表达的模板，并在蛋白翻译体系中加入适量的h L a 或突变体进行干预。结果表明，H B s A g 和H B e A g 在除对照体系外的各个转录体系中均可顺利表达，但表达量在S D S P A G E 胶上无法比较，可能与试剂盒的表达产量或荧光标记的灵
16、敏度以及翻译模板的浓度有关。尽管H B VR N A 在体外系统中可以较好的进行转录，但是以H B V 全基因为模板的翻译却无法在体外进行，表明在体外无细胞体系中完成H B V大片段蛋白的表达和H B V 复制难以实现，这也说明H B V 的复制需要在体内复杂的环境下进行，也是与H B V 的嗜肝性特征相吻合的，这一过程的完成可能需要一种或几种因素的共同调节。可见，h L a 作用的发挥也可能需要依赖于体内其它因素的辅助。采用电化学发光法检测了体外表达的H B s A g 和H B e A g 的含量，以更精确的分析各个转录翻译体系表达的差异。电化学发光检测的结果表明，h L a 和D e L l 对H B V全基因和全S 基因的H B s A g 表达量有促进作用，但D e L 2 和D e L 3 的作用无统计学意义。表明h L a 可以促进H B s A g 的体外表达，当大片段缺失突变( D e L 2 和D e L 3 )后，造成h L a 的空间结构改变而丧失这种促进作用。h L a 对于H B e A g
