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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ PCR 法检测骨髓间充质干细胞移植到梗死法检测骨髓间充质干细胞移植到梗死心肌后的存活数量心肌后的存活数量作者：王业焕，张浩，袁昕，侯剑锋，刘学彬，叶珏，孙成超 作者单位：(1.温州医学院附属第一医院 心胸外科，浙江 温州 325000;2.中国医学科学院阜外心血管病医院、 卫生部心血管疾病再生医学重点实验室，北京 100037;3.中国医学科学院阜外心血管病医院 中心实验室，北京 100037)【摘要】 目的 ：建立一种干细胞移植到梗死心肌后检测其存活数量的有效方法。方法 ：选取 10 只雌性 SD 大鼠结扎前降支，心肌梗死 3 周后，随机分成移植组与
2、对照组，同时选取雄性大鼠培养出骨髓间充质干细胞(MSCs)，分别将 MSCs(3106 个，50L)及等体积的 PBS 液移植到梗死心肌中，24 h 后通过实时定量PCR(Real-time PCR)检测雄性大鼠 Y 染色体上特有的基因 SRY，从而得知移植 MSCs 的存活数量。结果：MSCs 移植 24 h 后，移植组梗死心肌中检测到 SRY 基因数占移植总数的 14.9%8.3%，存活细胞的绝对数量为 447 195248 090，而对照组均未检测到 SRY 基因的存在。结论：用 Real-time PCR 的方法能有效地检测到具有 SRY基因的干细胞，从而能准确地得知移植干细胞的存活数
3、量，Real-time PCR 技术在心梗后干细胞移植的基础研究及临床应用中具有重要的价值。【关键词】 实时定量 PCR;心肌梗死;细胞移植KKME-专业医学搜索引擎 http:/ of the survival number of the bone marrow derived from mesenchymal stem cells implanted into myocardial infarction with Real-time PCR WANG Ye-huan*，ZHANG Hao，YUAN Xin，HOU Jian-feng，LIU Xue-bin，YE Jue，SUN Cheng
4、-chao. *Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou，325000Abstract: Objective: To establish an effective method to detect surviving number of the stem cells in vivo. Methods: Ten adult female SD rats were randomly assigned into
5、 two groups: the bone marrow derived from mesenchymal stem cells (MSCs) transplantion group and the control group. Anterior myocardial infarction was induced by ligation of the proximal left anterior descending artery. Using an insulin syringe， PBS (50L) and MSC (3106/50L) of male rat sources were i
6、njected into infarcted area in transplantation group and control group，respectively. To evaluate the viability of MSCs injected into infarcted area， Real-time PCR was used to detect the SRY gene which is a specific marker of Y chromosome in 24 hours after MSC transplantation. Results: Twenty four ho
7、urs after MSC transplantation， the cells were detected in the infarcted myocardium in six rats of transplantation group. The number of surviving cells was 447 195248 090 ;the number of detected SRY to the number of transplanted cells was 14.9%8.3%. In contrast，no sry gene were detected in control gr
8、oup. KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Real-time PCR is a sensitive and accurate method to detect the viability of transplanted stem cells in infarcted myocardium， and this method is valuable for both the laboratory study and clinical practice in the field of stem cell therapy for myocardial infarction.Key words
9、: Real-time PCR;myocardial infarction;cell transplantation心肌梗死后，心肌细胞可出现永久性的丢失，且成熟心肌细胞不可再生，现有治疗手段也无法促使心肌细胞再生，因此，使用干细胞移植到受损心脏中替代坏死心肌细胞，以修复心肌结构和功能，近年来备受广大研究者的关注并已取得了令人鼓舞的成果。但其也存在着很多有待解决的问题，其中的核心问题是移植干细胞在宿主体内的去向和命运。由于技术上的原因，目前尚难以对干细胞移植后在体内的存活、滞留、分布情况进行准确量化。为了追踪观察移植干细胞的存活、滞留、分布情况，必须运用一种有效的检测手段来对移植细胞加以识别和
10、监测。我们利用实时定量 PCR(Real-time PCR)的方法有效地检测出具 SRY 基因的干细胞在梗死心肌中的存活数量，这为干细胞移植到梗死心肌后检测其存活量提供了一种有效的检测方法。1 材料和方法1.1 实验动物 10 只 SPF 级雌性 SD(Sprague-Dawley)大鼠，体重 200250 g，用来制作心梗模型;2 只雄性 SD 大鼠，体重6080 g，用来培养骨髓间充质干细胞。实验动物均由北京市维通KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 心梗模型的制作 结扎雌性 SD 大鼠左室前降支近端来制作心肌前壁梗死模型。用 10%的水合氯醛 3 mL/kg 进行腹腔注射，当大鼠完全
11、麻醉后，用 18 G 的静脉内导管针经口气管插管，每分钟给予 23 L 氧气，经左第四肋间进入胸腔，显露出心脏，在左心耳和肺动脉圆锥间用 6-0 polyproplene 线结扎左室前降支，成功的心梗模型可见到结扎远处心肌颜色由粉红变为苍白，同时心电图机上显示出室性心律失常波形，切口用 3-0 的丝线逐层缝合1。1.3 移植细胞的培养 利用全骨髓贴壁法得到原代间充质干细胞。MSCs 培养在含 15%的热灭活胎牛血清及 100 U/mL 青链霉素溶液中，细胞孵育放置在 37 包含有 5% CO2 和 95%的湿度的孵育箱中2。试验所用的细胞均为第三代细胞。1.4 细胞移植 从培养瓶中消化下第三代
12、间充质干细胞，在倒置显微镜下准确地细胞计数。心梗 3 周后，随机将心梗大鼠分成移植组(n=6)与对照组(n=4)，将大鼠麻醉后在左胸第五肋间开胸，用胰岛素针抽取含有 3106 个 MSCs 的 PBS 悬混液 50L，注射入梗死区。对照组注射同体积的 PBS 液。1.5 取材 细胞移植 24 h 后，将大鼠全身麻醉，静脉快速推注高浓度 KCl，心脏停搏在舒张期，迅速剪下心脏，用 PBS 冲洗尽血液，剪下左室游离壁称重放入液氮中贮藏至 DNA 的提取3。1.6 用 Real-time PCR 定量分析 Y 染色体 DNA 细胞和组织KKME-专业医学搜索引擎 http:/ DNA 利用 Wiza
13、rd Genomic DNA Purifi-cation Kit 提取，提取后的DNA 用 100L 试剂盒中的 DNA 再溶解液溶解，用分光光度测定法测定 DNA 的纯度及总量。Real-time PCR 用 SYBR-Green I 法执行。SYBR-Green I 染料与双链 DNA 结合发出荧光信号。应用 7300 Real-time PCR System(ABI 公司提供)来检测荧光信号。目的基因位于雄性 SD 大鼠 SRY 基因上一段特定的序列。用雄性 SD 大鼠骨髓间充质干细胞的 DNA 来做标准曲线。引物(10M)分别为 5-CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA-3和 5
14、-ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC-34。每个待检样品中包含有：10L 的目标 DNA、每条引物各 1L、12.5L 的 Power SYBR Green PCR Master Mix (ABI 公司提供)和 0.5L 的 DEPC 水。循环条件是：95 预变性 10 min，95 变性 15 s，60 退火 1 min。样品扩增后，用获得的溶解曲线来判定特异性产物及非特异性产物。1.7 统计学处理方法 两样本均数的比较用 t 检验。2 结果10 只大鼠均成功地建立起心肌梗死模型，二次开胸细胞移植后大鼠均存活。组织 DNA 经提取后，利用 Real-time PCR 对 SRY基因数
15、进行检测，基因扩增曲线符合分析标准，结果在细胞移植 24 h 后移植组大鼠左室游离壁可检测到的 SRY 基因数为 447 195248 090，占移植总数的 14.9%8.3%，而在对照组均未检测到 SRY 基因。具体数据如表 1 所示(1#6#为移植组，7#10#为对照组)。3 讨论KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 半乳糖苷酶活性分析和 TUNNEL 染色分析，但是这些方法都是半定量的，不能提供准确有效的细胞存活数据。Y 染色为雄性动物细胞核内特有，我们可以利用这个特点对 Y 染色体中某个特定的基因进行准确有效地检测，从而得知细胞数量。1999 年 Lee 等10就利用这个特点成功地检测到了移植到女性体内的男性白细胞的存活数量。2002 年 M?ller-Ehmsen 等11将致死的新生 Fischer 344 大家的雄细胞移植到雌性的心脏中后用 Real-time PCR 检测 SRY 基因的数量，在 1 h 后可检测到 33%，24 h 后仅可检测到 2.2%。因此我们可以将 Real-t
