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1、AHLs 信号分子降解酶的研究进展魏金亚 摘摘 要要：群体感应（Quorum-sensing system, QS）是原核生物和真核生物中与细胞群体密度相关的通讯机制，参与许多生物学功能的调控。酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine laetone)AHLs)是调控QS系统的关键信号分子。通过限制AHLs的浓度来调控与QS相关的生物学功能在理论和实践上具有重要意义。本文从AHLs信号分子的降解为入口，简要概述了AHLs降解酶的种类、特点特性、生物学功能，并对其在生防和药理学上的应用进行了综述和展望。关键词关键词：群体感应 AHLs 抑制 AHL-内酯酶 AHL-酰化酶 AiiA A
2、ttM群体效应（Quorum-sensing system，QS）普遍存在原核生物之间和原核生物与真核生物之间，即细菌感知周围环境同种细胞密度调节其基因表达的现象。AHLs 是 G-细菌进行群体效应胞间通讯的关键因素，细菌通过感知这种信号分子来感知细胞密度的阈值。AHLs 能够引发大量与细胞密度或生长时期有关的反应，如生物发光，抗生素合成、细胞游动和聚集、质粒接合转移、生物膜维持和分化、胞外酶合成及人和高等植物致病毒力产生等等1-3。目前已经从一些原核生物和真核生物中鉴定出一些群体感应降解酶，这些降解酶可能降解细菌QS 系统的信号分子 AHLs，干扰细菌 QS 系统，抑制致病基因的诱导表达，破
3、坏其参与调控的生物学功能。在农业(防治植物病害)、医学（以 QS 系统的调控位点作为靶位来筛选抗药性物质）、环保(蓝藻水华)等研究方面具有重要意义。AHLs 降解酶的种类、特点特性、生物学功能、作用机制以及在生防和药理学上的应用前景等几个方面的研究现状进行了综述。1 AHLs降解酶种类降解酶种类研究结果表明，许多动物（包括人类）和植物中的病原细菌如玉米细菌性枯萎病菌、菊欧文氏菌、嗜线虫致病杆菌、铜绿假单胞菌和欧文氏胡萝卜软腐病菌等都是依赖AHLs信号分子来实现对其致病因子的合成7-12。在原核生物以及真核生物中都存在着具有活性的AHL降解酶。目前研究比较多的是两类AHLs降解酶：AHL-内酯酶
4、(AHL-1actonase)和AHL-酰化酶(AHL-acylase)。AHLs内酯酶是最早在原核生物当中发现的，能够破坏AHLs信号分子并使其失活的一种降解酶，也被称为群体感应淬灭酶，由aiiA基因编码。最早从革兰氏阳性菌芽抱杆菌240B1中克隆得到4，现已从苏云金芽孢杆（Bacillu thuringiensis，Bt）、蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus，Bc）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，Bs）等中成功扩增出了aiiA基因，并对aiiA基因的融合表达、AiiA蛋白结构及抗菌作用做了进一步的研究5-8,12,29，该酶广泛存在于土壤真菌中，获得比较容易，
5、应用前景较好。AHL酰化酶也能够降解AHLs信号分子，且能使其彻底丧失生物活性。但这种酶由于不广泛存在，目前对它的研究并不是很多。例如在假单胞菌中发现的AHL酰化酶，能够降解长链信号分子并使其失活4。在其突变株中还发现了另一个编码AHLs酰基转移酶的基因quiP，不过这个基因的协调方式目前还不清楚9。目前在真核生物中发现三种AHLs信号分子降解酶。一种是Greenberg等在动物的细胞中检测到的酶，能够降解AHLs信号分子致其失活18；一种是猪肾脏中的酰基转移酶18；第三种酶是在植物中发现的指状岩褐藻产生的卤素过氧化物酶，它能够催化产生卤素氧化物，从而破坏AHLs信号分子10。近几年也有新进展
6、，例如邱健等首次筛选到一株能够降解AHL的酵母菌,经鉴定为红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)这一发现丰富了群体感应淬灭酶的来源11 。2 AHL 降解酶的作用机制和特性降解酶的作用机制和特性目前研究发现两种作用机制,第一种是AHL-内酯酶能水解AHL内酯键,产生活性较低的酰基高丝氨酸；研究发现该酶具有同许多金属酶类相似但略有不同的保守结构HXHXDH12-14 。Uroz等人最新报道了一种新的作用机制，从R.erythropolis菌中发现一个新的降解AHLs信号分子的酶（qsdA） ，该基因编码的是Phosphotriesterase（磷酸三酯酶） ，其作用方式
7、和内酯酶相似，但其分解AHLs的能力具有菌专一性15另一种是AHL-酰化酶可以水解AHL酰胺键，产生无活性的高丝氨酸内酯和脂肪酸，为不可逆反应，且脂肪酸可以被细菌进一步利用16（图） 。对于AHL酰化酶的酶催化机制和底物特异性相关报道还不是很多。例如从罗尔斯顿菌（Ralstonia sp.) 中得到的由aiiD编码的AHL酰基转移酶可以将AHLs信号分子水解为内酯环和酰氨链16。图 AHLs信号分子降解两条途径示意图3 AHLs生物学功能生物学功能在自然界中，有很多微生物能够产生AHLs信号分子降解酶16,17,18。现在，有越来越多的证据显示，AHLs信号分子降解酶参与着微生物之间的相互作用
8、，并调控着微生物的生理习性等。苏云金芽孢杆菌能够通过产生AHLs内酯酶，能抑制植物病原菌致病因子的表达。产生AHLs内酯酶的苏云金芽孢杆菌可以有效地抑制欧文氏胡萝卜软腐病菌的细胞在植物组织中的扩散，但并不影响自身生长。表达AiiA的转基因植物可以降解致病菌QS系统的信号分子，明显增强了对胡萝卜欧文氏菌感染的抗性。而aiiA基因的突变株则不能阻止病原菌的群体感应信号转导，最终导致致病原菌的迅速扩散。这些结果表明，AHLs内酯酶影响着微生物不同种群之间的信号交流及相互作用，可以提高其产生菌的环境竞争力。Wopperer等人19发现在表达aiiA 基因的不同种伯克霍尔德菌(Burkholderia
9、sp.)菌株中，大部分菌株生物膜内细菌生物量降低，只有少数菌株膜内细菌生物量增加或无变化，暗示AiiA对生物膜形成的抑制作用比较广范。07年王瑶等人将苏云金芽孢杆菌的aiiA基因克隆至Pseudomonas/E.coli穿梭载体并转入铜绿假单胞菌PAO1菌株，通过检测信号分子和重要毒力因子，以及对丛集运动、生物膜形成和结构的影响，发现该基因的表达不仅能够降低毒力因子的表达，而且能够影响生物膜的形成和分散20。Romero等研究发现，鱼腥藻（Anabaena sp.）PCC120其细胞群体存在AHLs浓度调节机制，分离得到具有AHL降解活性的aiiC基因，属于酰基转移酶21，在蓝藻基因组中也发现
10、了这种酰基转移酶的同源序列，并证实广泛存在21，说明aiiC基因除了在蓝藻中参与AHL浓度的自我调节外，还可能作为一种避免外来信号干扰的自身信号系统的屏障。4 AHLs降解酶在生防和药理学上的应用研究降解酶在生防和药理学上的应用研究目前总结主要从两个方面防治动植物病害，一种是利用合成内酯酶的细菌或携带外源AHLs内酯酶的工程菌。比如：Molina将aiiA导入荧光假单胞菌( Pseudomonas fluorescens ) P3构建生物防治工程菌株，其产生的内酯酶AiiA，不但可以防治马铃薯软腐病的发生，而且对其还具有一定的治疗效果22。宋水山等从两株苏云金芽胞杆菌的基因组DNA中克隆到2个
11、aiiA基因ss1和ss1023。酶学特性研究表明SS10蛋白具有广谱的底物特异性；在马铃薯软腐病的抗病实验中，不论是纯化的AHL内酯酶24，还是重新构建的重组荧光假单胞菌25，均表现出明显的抑制作用。表达aiiA基因的转基因魔芋叶片的蛋白可以降解信号分子26；表达aac基因的烟草在抗病性研究中，与对照相比达到中等抗性水平27；一种是获得转基因植物。比如：Dong等证实源于Bacillus sp.的aiiA基因导入马铃薯，获得转基因植株，其产生的内酯酶AiiA能降解马铃薯软腐病菌的群体感应信号分子AHLs，抑制马铃薯软腐病的发生28。马宏等aiiA置于CaMV35S启动子下构建双元载体，利用根
12、癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化拟南芥（Arabidopsis thaliana），通过抗性筛选和分离获得纯合转基因拟南芥株系。PCR及RT-PCR分析表明，目的基因在转基因拟南芥中整合并表达这些研究表明，将抑制信号分子的基因转化植物，获得的转基因植物是可以破坏群体感应，从而减弱病害程度，达到生物防治的效果29。谷春艳将attM导入大肠杆菌后，经与胡萝卜软腐果胶杆菌混合，接种彩色马蹄莲，对病原菌的生长几乎没有影响，但抑制了其致病性30。其功能与当前国际植物病理界研究热点的aiiA基因相似。AHLs降解酶在药理学方面的研究报道并不多，但其在医学界的前景是肯定
13、的。目前将苏云金芽孢杆菌的aiiA基因转入可引起呼吸道感染、败血症、骨髓炎、心内膜炎和尿路感染等疾病的铜绿假单胞菌PAO1菌株中，影响了生物膜的形成，降低了毒力因子的表达20。细菌生物膜的形成可使细菌逃逸抗菌药物和机体免疫系统的作用，是细菌产生抗药性，这说明将降解基因转入人或动物当中降解致病性是可行的，为解决临床治疗细菌感染奠定了基础。3 结语结语通过采用一种降解致病菌产生的 AHLs 信号分子的方法来控制细菌侵染逐渐成为一种新的研究趋势。细菌的群体感应降解酶为生物防治群体感应依赖型的细菌侵染提供了可能的途径，但当中也存在不足，比如一些酶的作用机制还不太清楚，还有转基因植物是否对人体产生其他的
14、影响，尚且不太清楚，目前对 AttM 基因簇的研究不太多，将降解酶转入人或动物当中的报道还不太多。李老师：由于对分子方面了解甚少，通过阅读文献也没能在结语处写出新的观点。李老师你帮我看看，看能不能就咱们最近的实验提出一个关于此酶在蓝藻当中的研究方向。你先看看吧！参考文献：参考文献：1Miller M.B.,Bassler B.L.Quorum sensing in bacteria,Annu.Rev.Micriobiol.2001,55:165-199.2Swift S.Downie J.A. Whitehead N.A. et al. Quorum sensing as a populati
15、on-density-dependent determinant of bacterial physiology.Adv.Microbial Physiol.2001,45:199-270.3Whitehead NA,Barnard AML.,Slater H., et al. Quorum sensing in Gram-negative bacteria.FE-MS Microbiology Revs.2001,19,631-641.4Sio,C.F.,et al.,Quorum quenehing by an N一acyl一homoserine lactone acylase from
16、Pseudom-onas aeruginosa PAO1.Infect lrnmun,2006.74(3):p.1673-82. 5黄天培,姚帆,黄张敏,等. 苏云金芽孢杆菌8010aiiA基因的克隆及序列分析C杨怀文.迈 向二十一世纪的中国生物防治.北京:中国农业科技出版社,2005:250-255. 6黄天培,杨梅,姚帆,等.蜡质芽孢杆菌aiiA基因的克隆及融合表达J.福建农林大学学报:自然 科学版,2006,35(3):292-297. 7Dong Y H,Zhang L H.Quorum sensing and quorum-quenching enzymesJ.Journal of Microb- Iology,2005,43:101-109.8Dong Y H,Zhang X F,Xu J L,et a1.Insecticidal Bacillus thuringiensis silences Erwi
