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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ TCR 链链 CDR3 谱系的荧光定量谱系的荧光定量PCR 溶解溶解作者：田丹,孙永萍,汤贤英,马锐 作者单位：1.遵义医学院 免疫学教研室， 贵州 遵义 563003【摘要】目的： 利用荧光定量 PCR 溶解曲线分析技术检测 1 例多系统萎缩患者 TCR 链 CDR3 谱系。方法： 提取 1 例多系统萎缩患者和 1 例正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)中的总 RNA，逆转录成 cDNA，以 32 个人 TCR 链胚系可变区基因家族 (TRAV)设计上游引物，共同的TCR 链恒定区基
2、因家族(TRAC)设计下游引物，荧光定量PCR(FQPCR)扩增 32 个 TRAV 基因各家族 CDR3 谱系，溶解曲线法分析各家族 CDR3 谱系的单、寡、多克隆增生，挑选单克隆进行PCR 扩增，扩增产物行普通琼脂糖凝胶回收后测序分析。结果： 多系统萎缩患者和正常人 PBMC 的 32 个 TCR 链 TRAV 家族CDR3 谱型的 FQPCR 产物的各家族相对定量表达不一;正常人的32 个 TCR 链 TRAV 家族 CDR3 谱型的溶解曲线图表现为多个峰型的高斯分布，多系统萎缩患者的 TRAV10、TRAV15、TRAV29家族 CDR3 谱型的溶解曲线表现为单峰的克隆性增生，其他家族
3、为多峰、寡峰的多克隆及寡克隆增生，未出现缺失的家族，对单峰的TRAV15 家族的测序得到的 CDR3 区的氨基酸组成为：SAIYFCAEDRDSTLTFG。结论： 该多系统萎缩患者的 PMBC 中，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ TCR 链 CDR3 谱系漂移。【关键词】 多系统萎缩,互补决定区,荧光定量 PCR,溶解曲线Abstract Objective: To analyze CDR3 spectratype of TCR alpha gene in peripheral blood monouclear cells (PBMC) of one patient with mul
4、tiple system atrophy (MSA) by using DNA melting curve technique with realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction.Methods: Total RNA from PBMC of a healthy donor and a MSA patient were transcripted reversely into cDNA respectively.The forward primers were designed according to the 32
5、 human TRAV gene families, and the reverse primers designed according to TRAC. FQPCR was carried out to amplify CDR3 spectratyping of the 32 human TRAV gene families (HTGF), and the monoclonal/oligoclonal/polyclonal CDR3 were analyzed with DNA melting curves. Monoclonal T cells of TRAV families were
6、 amplified and sequenced. Results: The FQPCR products of HTGF of the MSA patient were different from those of normal people. The 32 HTGF melting curves of normal people showed Gaussian distribution with several peaks, while those of the MSA patient showed monopeak cloning increase in TRAV10, TRAV15,
7、 and TRAV29 gene families, and multipeak/oligpeakmultclone/oligclone increase in other gene families. No deletion family was found. The CDR3 amino acid sequence of TRAV15 which showed monopeak was inferred as KKME-专业医学搜索引擎 http:/ according to the DNA sequence obtained. Conclusion: There might be spe
8、ctratyping drift in CDR3 on TCR alpha chain in PBMC of MSA patient.Key words multiple system atrophy;complementarity determining regions; realtime fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; melting curve多系统萎缩(multiple system atrophy，MSA)是一组原因未明成年起病的神经系统多个部位相继进行性萎缩的疾病或
9、综合征。由于该病患病率较低，症状与帕金森综合征、震颤麻痹症等神经病症相似，早期明确诊断比较困难，目前也尚无特异性的治疗方法，临床以对症治疗为主，患者预后较差1，2。目前，多系统萎缩的相关研究主要集中在分子生物学及蛋白质病理学领域，而在免疫学方面少见研究报道3。近年来，TCR CDR3 谱型的免疫指纹技术在病毒感染、肿瘤、自身免疫病的研究中得到了较为广泛的应用,但受到较多关注的是 T 细胞 TCR 链 CDR3 谱系的研究，而 TCR 链谱系研究报道较少4。前期研究中已建立起检测 TCR 、 链CDR3 谱系漂移的“免疫扫描谱型分析技术“和“荧光定量溶解曲线分析技术“，并对 1 例 MSA 患者
10、外周血 TCR 链 CDR3 谱系进行了初步的探讨58。现拟通过对该例患者 TCR 链 32 个家族的CDR3 谱系进行分析，初步探讨 TCR 链 CDR3 谱系的变化及这种变化在 MSA 疾病过程中的可能意义，为进一步增加病例样本的研究提供基础。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 材料和方法1.1 研究样本及细胞株1 例多系统萎缩患者，按多系统萎缩临床诊断标准确诊8。患者外周血，来源于遵义医学院第一附属医院;对照样本为正常志愿者外周血。对照子宫颈癌细胞株(JEC)，由遵义医学院微生物学教研室提供。1.2 试剂总 RNA 提取试剂盒(TIANGEN)、cDNA 合成kit(MBI,Fer
11、mentas)，Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)等。1.3 引物设计与合成参照文献57，合成人 TCR AV32 基因家族上游引物 34条(TRAV1 和 TRAV4 分别有 2 个亚家族)，共同的 TCR AC 下游引物 1 条，对照的 GAPDH 上、下游引物，由 invitrogen 上海英骏生物技术有限公司合成。1.4 总 RNA 提取和 cDNA 合成分别采集多系统萎缩患者和正常人外周血 5 ml,按密度梯度离心法分离 PBMC, 按总 RNA 提取试剂盒操作，提取 JEC 细胞、1例多系统萎缩患者和 1 例正常人外周血单个核细胞(peripheral
12、blood mononuclear cell， PBMC)(2106 细胞)中的总 RNA，按 cDNA kit条件，用 Oligo dT 引物逆转录制备 cDNA。1.5 TRAV 家族 CDR3 区段 cDNA 的 FQPCR 扩增反应体系：每例样本做 36 个 PCR 反应管，第 134 管分KKME-专业医学搜索引擎 http:/ TRAV1 至 TRAV32 上游引物 1 l(各引物浓度均为 10 mmol/L,TRAV1 和 TRAV4 分别为 2 个亚家族)，134 管每管加入TRAC 下游引物 1 l，第 35 管加 GAPDH 上、下游引物，第 36 管为无引物的阴性对照管;
13、每个 PCR 反应管分别加样品 1 l、荧光定量 Mix 10 l、纯水 7 l，总体积 20 l;标准曲线选取 JEC 细胞株的 GAPDH 表达量为相对量标准进行 PCR。反应条件：(1)94 3 min，1 cycles; 94 30 sec，55 30 sec，72 50 sec，45 cycles;72 10 min，1 cycles;(2)溶解曲线分析：7595 以 0.2 /s 读取荧光值，100 cycles;(3)溶解曲线分析后的PCR 产物按上述反应条件(1)的步骤将 45 cycles 改成 5 cycles 进行PCR，取 8 l PCR 产物在 1.5%琼脂糖凝胶内进
14、行电泳，余-20 保存备用。1.6 PCR 产物序列分析反应体系：TRAV15 的 FQPCR 产物 2 l，加入TRAV15 上游引物 2 l(引物浓度均为 10 mmol/L)，加入 TRAC 下游引物 2 l，Taq DNA Polymerase 0.25 l，2 mmol/L dNTP 5 l，10 倍 Buffer with KCL，MgCl2 5 l，25 mmol/L MgCl2 3 l， DDW 30.75 l，总体积 50 l。反应条件：95 2 min，1 cycles;95 30 sec， 60 1 min，72 1 min，35 cycles;72 10 min，1 c
15、ycles。2 结果2.1 正常人 PBMC 的 32 个 TCR 链 TRAV 家族 CDR3 谱KKME-专业医学搜索引擎 http:/ FQPCR 产物溶解曲线峰图均为多克隆的高斯分布(图 1)。患者 PBMC 的 32 个 TCR 链 TRAV 家族 CDR3 谱型的 FQPCR 产物的各家族溶解曲线峰图中的 TRAV10、TRAV15、TRAV29 家族表现为单克隆增生峰图，其他家族为多克隆和寡克隆增生峰图，未出现缺失的家族(图 2)。2.2 对患者所出现的 TRAV 15 寡克隆性的 PCR 产物进行测序, CDR3 区的基因序列： TCA GCT ATC TAC TTC TGT GCA GAG GAT AGA GAC AGC ACC CTC ACC TTT GGG ACA GGG GAC TAT(图 3); 翻译后相应的 CDR3 区氨基酸序列：SAIYFCAEDRDSTLTFG(表 1)。3 讨论MSA 自 1969 年首次命名以来，至今病因不明，目前涉及的有脂质过氧化损伤、酶代谢异常、慢性病毒感染、神经元凋亡、少突胶质细胞胞质内包注：呈现单峰的家族为：TRAV10、TRAV15、 TRAV29;对照涵体等导致的进行性神经系统多系统变性13。在免疫学方面的研究，Hiroyuki9等
