《1低浓度MNNG激活内质网应激及其对EGFR通路的影响2内质网应激参与低浓度DNA加成性损伤剂诱发的细胞应答反应》由会员分享，可在线阅读，更多相关《1低浓度MNNG激活内质网应激及其对EGFR通路的影响2内质网应激参与低浓度DNA加成性损伤剂诱发的细胞应答反应（91页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学博士学位论文1.低浓度MNNG激活内质网应激及其对EGFR通路的影响;2.内质网 应激参与低浓度DNA加成性损伤剂诱发的细胞应答反应姓名：刘更申请学位级别：博士专业：生理学（病理生理学）指导教师：余应年20051201浙江大学博士学位论文刘更1 。 _ 。1 - - 。- 。_ 。- _ _ _ - - - 。_ _ _ 。_ 1 - _ _ 。- 。_ 。- 。_ _ 。 _ _ _ _ 。- - 。_ 。_ - 。一缩略语( A b b n v i a t i o n s )A T F 6 ：a c t i V a t i n gt f a n s c 却t i o nf a c
2、t o r6BSA：bovines e r u ma l b 哪i nB P D E ：b e r l z 0 【a 】p y r e n e 7 ，8 - d i h y d r o d i o l 一9 ，1 0 e p o x i d eB S B i s ( s u l f o s u c c i n i m i d y l ) s u b e r a t eD M S O ：D i m e m y lS u l f o x i d eE D l A ：D i s o d i u mE t I l y l e n e d i 锄i n e t e 缸a a c e 娥E G F R ：
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7、使用的种模式化学诱变剂和致癌剂，用于研究环境中广泛存在的N 一亚硝氨类诱变剂和致癌剂的致癌机制，它能和D N A 及蛋白质等生物大分子形成加合物( a d d u c t ) ，其引起的与突变有关的主要D N A 损伤是0 6 - 甲基鸟嘌岭，这种损伤与许多肿瘤发生密切相关。但是D N A 损伤并不是引起突变的必要条件，环境诱变剂引起的突变也可发生在非D N A 损伤部位，即非定标性突变( n o n t a r 嚣t e dm u t a g e n e s i s ) 。我们实验室曾用一特殊的突变检测系统，直接证明D N A 损伤剂可在哺乳动物细胞诱发非定标性突变：首先用低浓度( O 2
8、H M ) 的短寿烷化剂 帅I G ( 半寿期为1 ，1 1 1 r ) 处理细胞2 5 h 后，继续培养2 4 h ，将重组有用作突变检测的靶基因s 印凡R N A 基因的穿梭质粒p z l 8 9 转入细胞复制，发现在未受致癌物直接攻击的穿梭质粒中有较自发突变率高5 倍以上的靶基因突变。这种突变并非在接受M ：N N G 攻击以后立刻出现，而是具有时相依存性，在致癌物攻击后其发生率逐渐升高，在1 2 h 达最高峰，以后逐渐下降。且突变谱明显不同于由M N N G 直接攻击引起的定标性突变，有其突变好发部位的序列特异性。本实验室还证明在低浓度M N N G 诱发的细胞非定标性突变依赖于基因表
9、达改变，并证明在M N N G 处理细胞中有广泛的基因表达改变，伴有D N A 复制保真度的下降和D N A 聚合酶谱的改变。与D N A 聚合酶B 表达升高相关c A M P - P K A c R E B 信号通路在 孙小l G 处理细胞中被激活，且在去核细胞中也可发生，即它的激活并不依赖于基因组D N A 损浙江大学博士学位论文刘更伤所诱发。继而又证明M N N G 可诱发细胞表面受体如生长因子受体、肿瘤坏死因子受体的聚簇，它们也不依赖于细胞基因组D N A 的损伤。因此环境诱变剂诱发的细胞应答反应也不只是单纯地由D N A 损伤所触发的。自环境遗传毒物接触细胞开始，细胞可以通过以被证明
10、的细胞受体及其信号分子或其它未经证实的途径诱发了一系列广泛和复杂的应答反应以应对此不良环境。其中包括了即刻发生的并不依赖于核损伤信号的信号转导通路的激活和较迟发生的基因表达的改变。在M N N G 诱发的细胞表面受体如表皮生长因子受体信号通路的研究中，我们发现， 孙l N G 能够引起表皮生长因子受体的聚簇和肿瘤坏死因子T N F 一口的聚簇，这种表皮生长因子受体的聚集是和其配体表皮生长因子所导致的聚簇有相似的形态结构。但进一步发现，h d N N G 引起的这种受体聚簇对下游信号转导通路的影响是不同于由其配体诱发的。M N N G 诱发的受体聚簇不伴有R A s 蛋白的激活，而且，受体的一些
11、酪氨酸残基8 4 5 ，9 9 2 ，1 0 6 8 和1 0 7 3 也没有发生自身磷酸化：尽管M N N G暴露并不影响表皮生长因子受体与其配体的结合，然而在M h m J G 预处理后，F L细胞表皮生长因子受体不再因配体的结合而发生自身磷酸化，而且R A S 蛋白也不被激活。因此，我们猜测，M ：N N G 可能甲基化了一些氨基酸残基，从而改变了受体的空间构象，或者M M N G 促进了一些抑制性信号分子的表达，并结合到受体上，导致下游信号转导通路的阻断。为了进一步研究M N N G 导致的表皮生长因子受体信号通路阻断的分子机制，在本次研究中，我们用W e s t e m 印迹技术发现
12、，在体外系统中表皮生长因子在正常细胞裂解液中可引起其受体的磷酸化，但在0 2 5 岬o l L M N N G 预处理细胞的细胞裂解液中，这种磷酸化现象不再发生。另外，我们证实了0 2 5 和1 岫o l LM N N G 导致的表皮生长因子受体的聚簇的确是受体蛋白的二聚化，但在高浓度1 0 岬o l ，L 时虽有受体聚簇现象但并无受体蛋白二聚化的发生。然而，不同于配体的是，这种二聚化并不能被弱酸解聚，而且，用免疫沉淀技术证明下游R A sM A P K 起重要作用的接头蛋白G r b 一2 ，s h c 和s o s l 与受体蛋白的结合也不发生或被抑制。一个令我们兴奋的是，用免疫沉淀技术发
13、现在低浓度M N N G 处理细胞的表皮生长因子受体的免疫沉淀复合物中发现有内质网应激特异性蛋白质G R P 7 8 B i P 的存在。而当细胞裂解液中加入A T P 使这种复合物分离，表皮生长4浙江大学博士学位论文刘更因子又恢复被其配体磷酸化的功能。这个发现令我们深信内质网应激反应参与了M N N G 导致的F L 细胞表皮生长因子受体通路的阻断。内质网是调节蛋白质合成及合成后折叠、聚集的场所，也是调节和贮存细胞钙水平的重要场所，内质网通过复杂的网络关系和胞浆，核，线粒体以及细胞膜有着广泛的联系。在内质网腔上，进行着各种重要的脂质合成，c a ：贮存，和蛋白质的合成和折叠。因此，各种精细的
14、调节功能以保持内质网功能的稳定至关重要。缺氧，和未正确折叠蛋白在腔内聚集以及胞浆c a ! 。失衡均可以导致其紊乱，从而诱发系列相关蛋白质表达和细胞表型改变，称为内质网应激( E Rs t r e s s ) 又称为不折叠蛋白反应( u n F o l d e dD r o t e i nr e s p o n s e ，U P R ) 。内质网应激对决定应激细胞的结局如抵抗，适应，损伤或凋亡有重要作用。蛋白质在内质网腔形成空间结构由许多分子伴侣蛋白协助，其中最主要的是葡萄糖调节蛋白质G R P 家族的G R P 7 8 B i P ，当内质网腔内未折叠蛋白增多而与内质网中游离的G R P 7
15、 8 B i P 结合后，将抑制m R N A 的翻译，即蛋白质的生成，减少非正常折叠的蛋白质在内质网腔内的堆积，从而对细胞起保护作用恢复蛋白质正确构像：同时，转录因子A T F 6 及跨膜蛋白激酶P E R K 的活化可诱 发一系列内质网应激靶基因的转录表达。其中删劬勰卿( g r o w t ha r r e s ta n dD N Ad a m a g e 1 5 3 。) 基因的编码蛋白可降低B c 卜2 表达、使细胞谷胱甘肽耗竭引起细胞凋亡，从而在生长停止和细胞死亡中起作用。内质网应激反应时间过长或强烈，还将活化定位于内质网的半胱天冬酶一1 2 ，继而引起半胱天冬酶级联反应，导致细胞
16、凋亡用w e 啦m 印迹技术我们证明，在低浓度M N N G 处理的细胞中，一些内质网应激特异性蛋白质，G R P 7 8 B i P ，和G A D D l 5 3 c H O P 的表达都有明显升高，并伴有天冬半胱酶一1 2 的激活。这就充分证明低浓度M ：N N G 确可激活F L 细胞内质网应激反应。M N N G 预处理的纽胞表皮生长因子受体在袭解液中被其配体E G R 激活舶功能被阻断F L 细胞用D M s O 或o 2 5 M 或l p M 的M 恻G 处理3 0 分钟后溶于裂解液中，再分别以I O O n g ，m JE G F 继续孵育3 0 分钟，经聚丙烯酰氨凝胶电泳后。以抗磷酸化酪氨酸抗体做免疫印迹，来检测表皮生长因子受体被其配体诱发的磷酸化状态。结果：在 o I N G 预处理后，F L 细胞裂解液中的表皮生长因子受体不能再被浙江大学博士学位论文
