《卡维地洛对缺氧、再供氧心肌细胞缝隙连接通道蛋白43表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《卡维地洛对缺氧、再供氧心肌细胞缝隙连接通道蛋白43表达的影响（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 表达的影响表达的影响作者:曾玉杰,冯义柏 作者单位：中日友好医院心内科，北京市 100029 【摘要】 目的：检测卡维地洛(Cavedilol，CVD)对缺氧再供氧时心肌细胞缝隙连接通道蛋白 43（Conexin 43,CX43）的基因表达和 CX43 通道蛋白变化的影响。方法：原代培养心肌细胞，随机分为 2 组：未用药组，CVD 组。建立缺氧、再供氧模型，分别于正常、缺氧 30 min、再供氧 1 h、2 h、3 h、6 h 搜集细胞。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 CX43mRNA 表达、蛋白免役印迹法（Western blot）检测 C
2、X43 蛋白的含量。结果：未用药组的心肌细胞缺氧 30 min 时 CX43mRNA 表达与蛋白含量和正常相比无显著差异（P005） 。再供氧 1 h、2 h、3 h、6 h 则分别减少了3916%、4500%、4667%、5167%，和正常时相比差异显著（P005).The CX43 depression decreased 3916%、4500%、4667%、5167% in myocardial cells oxygen resupply for 1h,2h,3h and 6h(P001).In CVD group, comparing with normal， the expressi
3、on of CX43 decreased by KKME-专业医学搜索引擎 http:/ in oxygen resupply for 1h,2h,3h and 6h（P001）.The expression of CX43 of CVD group increased 4139% and 3916% in oxygen resupply for 1h and 6h,compared with control group(P001）.Conclusion:The CX43 mRNA level of cells and the content of CX43 protein significa
4、ntly decrease during myocardial cells oxygen resupply. The degradation of CX43 is inhibited by carvedilol.Authors address：Department of Cardiology, China|Japan Friendship Hospital;Beijing,100029,ChinaKey words：Carvedilol;Conexin43;Myocardium reperfusion 细胞缝隙连接（gap junction,GJ）是一个低阻力电通道，在细胞间进行着小分子物质和
5、离子的直接交换，使心脏进行同步收缩完成心脏泵功能。GJ 通道是由十几种缝隙连接通道蛋白（Conexin,CX）构成的，其中缝隙连接通道蛋白 43（Conexin43,CX43）是心室肌细胞含量最多一种，其数量对心肌的电机械活动有着重要的影响1本研究将在培养的心肌细胞缺氧、再供氧模型上研究 CX43 的表达数量及卡维地洛(Cavedilol，CVD)对其的干预作用。1 资料与方法11 原代心肌细胞的培养按 Higgins 等2建立的方法培养心肌细胞，即取生后 24 d Wistar 乳鼠，剪取心室，用 025%胰蛋白酶分离心肌细胞，以含 10%新生小牛血清的 DMEM 培养基制备细胞悬液，接种于
6、玻璃培养瓶中，每瓶细胞数为 3106 个，置KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 23 d 更换培养基一次，取培育 7 d 细胞单层进行实验。12 肌细胞缺氧再给氧损伤模型建立无糖 Hanks 液用高纯氮气饱和 30 min，使培养基氧分压低于 400 kPa。换用缺糖缺氧培养基后，培养瓶内立即充入氮气 1L/ min 流量 30 秒，以驱除瓶内氧气，然后塞紧瓶盖密闭培养，缺氧 30 min 后换用正常含糖的Hanks 液（95%空气+5%CO2）培养 1 h、2 h、3 h、6 h，造成再给氧损伤。检测细胞 CX43 的 mRNA 表达，并进行 CX43 蛋白定量检测。13 逆转录 PC
7、R 技术(reverse transcription PCR,RT-PCR)总 RNA 的抽取: 按 Trizol 一步法抽提正常、缺氧、再灌注时的心肌细胞 RNA。进行总 RNA 纯度、浓度及 RNA 完整性的检测，后进行逆转录反应及 cDNA 合成（RT） 和聚合酶链式反应(PCR)，引物分别为： CX43：5-CTCAAAGTGGCCCAGACTGAC-3； 5-GTGGTAAGGATCGCTTCTTCC-3。内标 -globin（肌球蛋白）: 5-CAACTTGATCCACGTTCACC-3； 5-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3。产物片段大小分别为 408bp和 270b
8、p。经反应和循环，PCR 产物留作电泳分析。观察及拍照，用计算机图象分析系统作光密度值测定，并经内参校正，确定 CX43基因表达的相对含量。14 心肌细胞 Western 印迹（blot）检测提取蛋白质，进KKME-专业医学搜索引擎 http:/ ，并作定量分析。15 给药方案未用药组：心肌细胞缺氧 30 min，分别在再供氧 1、2、3、6 时收取细胞，分别提取 RNA 和蛋白。另提取正常、缺氧 30 min 后的心肌细胞 RNA 和蛋白备用；CVD 组：用 CVD 原粉剂配成 1的浓度的培养液缺氧前 30 min 换用。其他同未用药组。16 统计学处理数值以均值标准差(s)表示，组间以 t
9、 检验进行统计学处理，P005 为差异有显著性。2 结 果21 模型及样品鉴定经心肌原代细胞的鉴定确认样品为心肌细胞，提取的 RNA 经紫外线测定 OD260/OD280 的比值均在18 以上，表明所提取的 RNA 纯度高，没污染，可用于 RT-PCR。细胞总蛋白质经 SDS 聚丙酰胺凝胶电泳分离后，凝胶用考马斯亮兰染色后（图 1）可见各蛋白条带清晰，染色好，表明蛋白没有降解，可用于 Western blot 检测。22 RT-PCR221 未用药组：正常心肌细胞 CX43mRNA 为120023，缺氧 30 min 为 118026，再供氧 1 h 为073037，2 h 为 066012，
10、3 h 为 064034，6 h 为09803。6h 时与正常心肌细胞相比 CX43 mRNA 减少了 52%,KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 2。图 2 未用药组 RT-PCR 电泳分析 CVD 组：在再供氧过程中，CVD 组不同时间段的 CX43mRNA 表达也有一定的减少（图 3） ，但减少的程度较未用药组明显减轻，于再供氧 6 h 时进行比较，两者 CX43mRNA 含量有显著性差异（P005） 。它们的减少的趋势如图 4。23 Western blot 检查结果在硝酸纤维膜上用 CX43 抗体标记显色，约 43kD 大小的分子显色，各个泳道的 43kD 的显色带反映了 CX
11、43 的含量多少。计算机扫描分析各组的每个时间点蛋白的平均含量，如表 1 所示，再供氧 6 h 时，CVD 组 CX43 蛋白减少程度较未用药组轻（P001） 。注：与未用药组相比P001。表 1 不同时间点各个组 CX43 蛋白含量的 OD 值(3 讨 论CX 基因表达的改变、新的 GJ 通道的合成和已有的通道的降解对心脏的各种功能有重要的影响3 。 Saffitz 研究发现，CX43 的多肽蛋白的半衰期在 13 h，溶酶体、蛋白酶体参与了CX43 的降解4 。随着缺血再灌注时间延长，蛋白酶释放增多，可能是 CX43 急剧减少的原因之一。 Fernandez-Cobo 等5通过对肝脏进行缺血
12、再灌注 1 h 后 Western 印迹检测发现 CX43 蛋白明显减少。在给大鼠运用了细菌提取的脂多糖后，心肌也有类似的 CX43蛋白减少，这实验说明 CX43 的表达和炎症反应有关。进一步研究发现，肿瘤坏死因子（TNF-a）因子可以减少 CX43 基因的激动子的KKME-专业医学搜索引擎 http:/ CX43 基因表达减少。在缺血再灌注心脏中 TNF-a 等细胞因子表达明显增多，因此，TNF-a 也可能是缺血再灌注 CX43急剧减少的原因之一6 。在用 CVD 干预后，CVD 组再供氧时CX43 mRNA 表达及 CX43 蛋白下降程度较未用药组减轻明显（P001） 。关于对 CX43
13、降解的影响可能与 CVD 的以下几个方面有关：首先是 CVD 的 受体拮抗作用，使心肌细胞的起搏频率减慢，心肌细胞的耗氧量减少，增加了对缺氧的耐受性； 受体的拮抗使 cAMP 减少，相应地使 GJ 的通透性下降，Ca2+传递减慢，心肌细胞受损减轻。 受体的拮抗还可以使心肌代谢由脂肪酸转向葡萄糖，进一步降低氧耗。其二，CVD 强力的抗氧化作用可拮抗心肌缺氧产生的氧自由基所致的损害7 。其三，CVD 的抗炎作用：现已知中性粒细胞在缺血再灌注心肌浸润和梗塞范围相关，在再灌注后，氧自由基、细胞因子以及其他炎症调节因子释放促使中性粒细胞浸润导致心肌损伤。CVD 明显减少中性粒细胞在缺血再灌注损伤心肌上的
14、聚集。CVD 可以通过抑制一个关键的细胞内粘附分子的表达（细胞粘附分子-1，ICAM-1） ，从而抑制中性粒细胞粘附到内皮细胞上，达到限制中性粒细胞引起的组织损伤8 。本研究表明CX43 表达减少主要和缺氧再供氧中诱发的急性炎症有关，通过相应的干预性治疗，可以有效地减轻 CX43 的降解，以达到减轻心肌损伤的作用，为今后相关的治疗提供了方向。【参考文献】KKME-专业医学搜索引擎 http:/ SB, Liu F, Zhang J, et al. Modulation of cardiac gap junction expression and arrhythmic susceptibilit
15、yJ.Circ Res，2004，95(10):1035-1041.2Higgins TJC,Bailey P J,Allsopp DCultured rat myocytes as a model for the study of myocardial ischaemic necrosisJ.J Pharm Pharmacol，1981,33(8-12):644.3Dank SB,Liu F,Zhang J,et al.Modulation of cardiac gap junetion expression and arrhythmic susceptibilityJ.Circ Res，2004,95(10):1035-1041.4Saffitz JE, Laing JG, Yamada KA，et al
