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1、中国协和医科大学博士学位论文11,12-EET作用于未成熟离体兔心的实验研究姓名：周明阳申请学位级别：博士专业：心血管外科指导教师：吴清玉2003.5.1中国协和医科大学博士论文前言随着小儿心脏外科的发展，未成熟心肌的保护越来越受到人们的重视。研究表明，未成熟心肌与成熟心肌存在着较大的差别，主要表现在：1 ) 结构不同：未成熟心肌细胞体积小，胞浆内细胞器疏松，糖原含量丰富，线粒体散在分布于核的周围及肌纤维之间；肌浆网不发达，形态结构均未成熟，肌浆网内与钙离子有关的球形颗粒含量少；细胞之间呈点状连接，较疏松，肌原纤维含量低，纤维直径小且短。2 ) 生化机能不同：未成熟心肌能够代谢各种物质，包括碳
2、水化合物、中短链脂肪酸、酮体和氨基酸，比成熟心肌有更强的无氧代谢能力。3 ) 对钙离子的调节不同：已普遍认为( 包括人体心肌细胞实验) 未成熟心肌钙通道发育不完善，其密度及活性明显低于成熟心肌；细胞发生兴奋时所需的钙离子主要靠细胞外钙离子内流提供，细胞内游离钙离子的浓度调节主要靠N g C a “交换系统来完成：未成熟心肌细胞内钙离子浓度低、收缩力小，伸缩速度慢。4 ) 对缺血、缺氧的耐受性不同：未成熟心肌比成熟心肌更能耐受低氧血症和缺血再灌注损伤。在临床实践过程中发现，对成人有良好心肌保护作用的心脏停搏液对婴幼儿效果并不理想，甚至出现心肌损害加重的现象。因此，在心内赢视术过程中，应采取有别于
3、成熟心肌的心肌保护方法。实验证实，与其它类型的心脏停搏液及保护手段相比，传统的S t T h o m a sN 0 2号停搏液结合低温措施能给未成熟心脏带来较为肯定的保护效果，已成为未成熟心肌保护的重要手段之一，然而仍存在许多不足之处。该保护液的高钾成分及低温措施能使细胞去极化，而处于电机械静止状态，减少心肌的代谢。然而，这种进展性的去极化同样导致跨膜离子电流，易导致氯离子内流及钠离子内流，细胞内钠离子增多，钠钙交换增多，钙离子从肌浆网渗漏，钙活性增强。由于未成熟心肌细胞调节能力较差，这些因素更容易导致心肌细胞钙超载、心肌水肿，这在心肌顿抑、冷挛缩、心律失常及再灌注损伤的发展中起到重要作用，最
4、终影响到未成熟心肌的保护效果。因此，近年来人们一直在研究一种方案，既能保留高钾及低温对心肌保护的优点又能弥补其中的不足。为达到这些目的，许多学者对心脏停搏液的成分、浓度、赋形剂、温度、灌注方式等因素进行了不断的深入研究和改进。以提高临床未成熟心肌的保护效果。近年的研究表明，机体内花生四烯酸经细胞色素P 4 5 0 单氧化酶代谢途径产I1 1 ，1 2 - E E T 作用于未成熟离体兔心的实验研究中国协和医科大学博士论文生的环氧化合物e p o x y e i x o s a t r i e n o i ca c i d s ( E E T s ) 是目前已证实的功能强大的内皮源性的心血管活性
5、因子之一，同时能产生多重以下的心血管效应：1 ) 心肌细胞的L 一型钙离子通道阻滞剂；2 ) 心肌细胞的K + 栅通道开放剂；3 ) 血管平滑肌细胞的c a 2 + 激活型钾离子通道( C a 2 + - a c t i v a t e dK + c h a n n e l sB Kc h a n n e l s )开放剂：4 ) 抑制心肌细胞的钠离子通道；5 ) 作用于心肌细胞时，尚能够产生类似于“缺血预处理”的效应。该因子是目前国外研究的热点之一，国外的分子生物学研究已证实E E T s 具有许多心血管方面的效应，可能在血液循环系统调节、心肌细胞损伤、离子运转的调节、信号转导途径的改变等方
6、面发挥重大作用，具有广泛的应用前景。由于上述效应，国外学者已逐渐将研究由分子水平转向临床方面应用的研究。从理论上看，作为其重要种类之一的1 1 ，1 2 E E T 能够抑制心肌缺血再灌注时钙超载，又能使心肌细胞处于一种“超极化状态”，而且能强烈扩张冠状动脉系统，这些特性都是心外科手术中心肌保护所必须的，能弥补当前心肌保护液的不足。国内包括我们的实验室在内的许多机构已开展相应的研究，但目前国内外尚未有与本课题相同的系统研究及报道。本研究旨在探讨该药物的不同作用方式对未成熟心肌的保护效果，并与传统的S t T h o m a sN 0 2 号液进行对比研究，探讨其作用机理及意义。21 1 ，1
7、2 一E E l “ 作用于来成熟离体兔心的实验研究中国协和医科大学博士论文A O主动脉缩略语表( 简写)K A T Pc h a n n e l sA T P 依赖性钾通道A S心律失常评分L D H乳酸脱氢酶B Kc h a n n e l s 钙离子激活型钾通道L V D P左室变化压C B E冠脉流量L V E D P左室舒张末期压C K磷酸肌酸激酶M W C心肌含水量C P G停搏液P C 0 2二氧化碳分压+ d p p t动脉压时间变化P 0 2氧分压H R心率T U N E L原位末端标记31 1 ，1 2 一E E T 作用于未成熟离体兔心的实验研究中国协和医科大学博士论文中
8、文摘要第一章：1 1 ，1 2 一E E T 预处理对未成熟兔离体心脏的影响目的：观察1 1 ，1 2 e p o x y e i c o s a t r i e n o i ca c i d ( 1 1 ，1 2 一E E T ) 预处理对离体未成熟兔心肌缺血再灌注的保护作用，并探讨其可能机制。方法：利用L a n g e n d o r f f 灌注装置，建立心肌缺血再灌注模型。2 4 只未成熟兔随机分成三组：对照组、缺血预处理组( I P C 组) 、1 1 ，1 2 。E E T 预处理组( E E T组) ，观察缺血2 h 及再灌注1 h 前后心功能变化( 左心室变化压L V D P
9、 、左心室舒张末期压L V E D P 、心室最大压力变化速率土d p p t 。，冠状动脉流量C B E 等) 、心律失常评分( A S ) 、心肌肌酸激酶( C K ) 、乳酸脱氢酶( L D H ) 等指标。实验结束后取心肌标本观察光学显微镜及透射电镜结构。结果：( 1 ) I P C 组及E E T 组心功能恢复、心律失常发生及心肌酶学变化指标均优于对照组，心肌光学显微镜结构及透射电镜结构亦优于对照组。( 2 ) 与I P C组相比，E E T 组的心肌含水量、C K 、L D H 均较低，冠状动脉流量则较大，心肌超微结构亦优于I P C 组。这两组的其余观察指标无显著性差异。结论：I
10、 P C 预处理及1 1 ，1 2 一E E T 预处理措施均能对缺血再灌注的未成熟兔离体心脏产生保护作用，其中，在1 1 ，1 2 一E E T 预处理措施中，心肌的损伤最小，提示该处理措施对心肌的保护效果最好。第二章：1 1 ，1 2 一E E T 对冷停搏未成熟兔心心功能及再灌注性心律失常的影响及意义目的：研究1 1 ，1 2 e p o x y e i c o s a t r i e n o i ca c i d ( 1 1 ，1 2 。E E T ) 作为心脏停搏液成分对未成熟兔离体心脏缺血再灌注损伤的保护效果及机制。方法：1 6 只未成熟兔构成随机分组样本，分成对照组( S t T
11、 h o m a sN o 2 液处理)和实验组( S t T h o m a sN o 2 液+ I l ，1 2 - E E T 处理) 。利用非循环式L a n g e n d o r f f灌注装置，测定心脏停搏2 h ( 1 5 。c ) ，再灌注l h ( 3 7 。C ) 过程的如下指标：( 1 )41 1 1 2 一E E T 作用于未成熟离体兔心的实验研究中国协和医科大学博士论文心脏灌注停搏液后的电机械活动停止时间和再灌注后电机械活动恢复时间。( 2 )心功能及血流动力学指标包括左心室变化压、左心室舒张末期压、最大压力变化速率和冠状动脉流量。( 3 ) 心率、心律失常活动及评
12、分。( 4 ) 心肌含水量、心肌钙离子含量、心肌酶C K 、L D H 改变以及心肌组织光学显微镜和透射电镜结构等。结果：实验组的电机械活动停止时间、心肌钙离子含量低于对照组。心律失常发生及评分、心功能恢复和心肌酶、心肌含水量、冠状动脉流量均优于对照组。两组之间的电机械活动恢复时问、心率变化无显著性差异。结论：传统的S t T h o m a sN o 2 停搏液中加入l l ，1 2 E E T 可促进未成熟兔心的停搏，减轻再灌注性心律失常，增强其对未成熟兔心缺血再灌注损伤的保护效果。第三章1 1 ，1 2 - E E T 对未成熟离体兔心长时问保存作用的初步探讨目的：观察n ，1 2 一e
13、 p o x y e i c o s a t r i e n o i ca c i d ( 1 l ，1 2 - E E T ) 作为心脏停搏液及保存液成分对未成熟兔离体心脏的长时间保存作用。方法：将4 8 只未成熟离体兔心按随机分配原则分成对照组( n = 2 4 ) 和实验组( n = 2 4 ) ，对照组采用S t T h o m a sN o 2 液为停搏液及保存液保存心脏，实验组采用S t T h o m a sN o 2 液+ 1 1 ，1 2 E E T 为停搏液及保存液保存心脏，心脏停搏后，在4 。C 条件下分别保存心脏8 h ，1 6 h ，2 4 h 。利用非循环式L a
14、n g e n d o r f f 灌注装置测定各组心脏保存前及保存后再灌注3 0m i n ( 3 7 0 C ) 的心率、左心室变化压、左心室舒张末期压、最大压力变化速率和冠状动脉流量，并测定心律失常评分、心肌酶肌酸激酶、乳酸脱氢酶含量及观察心肌组织光学显微镜和透射电镜结构的改变等指标。结果：( 1 ) 保存8 h ，1 6 h ，2 4 h 实验组的心功能恢复率、心肌水肿程度、心律失常评分均好于相应对照组，C K 、L D H 及心肌超微结构的改变亦明显优于相应的对照组。( 2 ) 心脏保存1 6 小时后，实验组的心功能恢复率为：H R ( 9 7 9 “ 1 8 4 )、L V D P
15、 ( 9 8 2 士2 1 3 ) 、+ d p p t m “( 9 8 5 4 - 1 2 2 ) 、一d p p t 。a x ( 9 6 3 1 5 7 )、C B E ( 1 0 0 7 士1 3 2 ) ，仍基本接近心脏保存前的相应值，而保存1 6 h 的对照组心功能指标为：H R ( 9 2 1 士2 5 3 ) 、L V D P ( 6 6 8 士6 5 ) 、+ d p p t r a a x5U ，1 2 - E E T 作用于来成熟离体兔心的实验研究中国协和医科大学博士论文( 7 4 2 ：t ：1 5 ，9 ) 、一d p p t 。( 7 5 7 + 1 4 3 )
16、、C B E ( 5 3 7 ：1 ：8 8 ) ，不仅明显低于相应的实验组而且明显低于保存之前。( 3 ) 心脏保存2 4 小时，尽管实验组各项心功能恢复率显著下降，但心脏仍全部复跳，对照组5 只心脏不能复跳。结论：S t T h o m a sN o 2 液中加入1 1 ，1 2 E E T 作为心脏停搏液及保存液成分联合保存未成熟兔离体心脏，可延长对心脏的保存时间并增强其保存效果。第四章1 1 ，1 2 一E E T 对长时间保存的未成熟兔供心心肌细胞垌亡及b c l - 2 m R N A 基因表达的影响目的：观察1 l ，1 2 e p o x y e i c o s a t r i e n o i ca c i d ( 1 1 ，1 2 E E T ) 作为心脏停搏液及保存液成分对未成熟兔离体心脏长时间保存后，心肌细胞蜩亡及b c l 。2m R N A 基因表达的变化，并探讨其可能机制及意义。方法：利用非循环式L a I l g e n d o r
