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1、杜仲遗传多样性的R A P D 分析王瑷琦，黄璐琦( 中国中医研究院中药研究所北京1 0 0 7 0 0 )杜仲( E u c o m m au m o d e sO i l y ) 是我国特有的药用植物国家二级濒危保护植物。其皮、叶供药用，植株内含有大量可供多种用途的杜仲胶。由于商业利润的驱使，杜仲资源不断遭受破坏，野生资源已濒临灭绝。目前杜仲的广泛分布源于人类的栽培。本文运用R A P D ( 1 k m d o mA m p l i 口 l i e dP o l i z n o p h i cD N A ) 技术对杜仲的遗传多样性进行初步研究，以期通过对杜仲栽培居群的分析，揭示种内遗传多
2、样性现状，为这一古老孑遗植物的保护提供指导。J 材料和方法1 1 材料实验所用的2 6 0 个样品为硅胶快速干燥的杜仲叶片，采自全国八省一市的2 0 个居群。产地具体见表1 ( 略) 。1 2 方法1 2 、1 总D N A 的提取取干燥叶片约O 2 m g ，置1 5 m l E p 管中，加入液氮用镊子研碎立即加入5 0 0 u l 保温0 0 。C 的C T A B 提取液 C T A B 2 ，T r l s H C I ( p H 8 0 ) 1 0 0 m m o L ，E D T A 2 0 t r u n o I L ，N a C l 1 4 m o l L 巯基乙醇2 口及巯
3、基乙醇2 0 u l 混匀，6 & C 保温加分钟；加入等体积的氯仿一异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提，轻轻颠倒混匀，1 0 0 0 0 r r a i n 离心1 0 分钟，吸取上清液，加入等体积的沉淀缓冲液 C T A B l ，T r i s H C l ( p H 8 0 ) 5 0 n m a o l L ，E D T A1 0 m m o l L ，巯基乙醇1 ，室温下放置3 0 分钟以上，1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 r a i n ，小心去掉上清液，分别用7 0 乙醇和无水乙醇各洗涤一次，弃掉洗液挥干。用T E 溶解D N A ，用核酸紫外定量仪测定D N A
4、 浓度，进行不同浓度扩增结果比较，由 F i g u e 3 可见，D N A 浓度在5 0 9 0 0 吲l l l 之闷扩增结果差异很小，因此确定D N A 浓度为5 0 n g 山。1 2 2R A P D 扩增反应反应体系：总体积为2 5 t z l ，其中模板D N A 约2 5 n g ，1 5 m M M g C l 2 ，T a q 酶2 5 U ，d N T P s各0 2 n 1 】1 1 1 ，引物为1 5 r a M 。扩增程序为9 6 预变性5 分钟9 4 4 5 s 、3 4 l m i n 、7 2 。C1 5 m i 。，4 0 个循环，后延伸7 2 5 m i
5、 n 。扩增产物于1 8 琼脂糖凝胶、1 T A E 电泳缓冲液电泳，紫外检测拍照( 图略) 。1 2 3 数据分析对凝胶紫外成像系统中重复性好且清晰的条带记数。用l ( 3 0 b pD N Al a d d e r 作分子量标记对照反应产物在胶上的位置，将迁移率相同的带作为同源位点处理得到1 、0 数据2 】( 有带计为l 。无带计为0 ) 矩阵，用S P S S1 0 0 分析软件中的J a c c a r a 方法计算样品间的相似系数，用W t h n g r o u p sl n k a g e 聚类分析方法，建立样品间的亲缘关系树系图。用u ) G M A 方法对各居群聚类( B
6、a s e d N e i s ( 1 9 7 2 ) G e n e t cd s t a n c e ) ，得聚类圈( 图略) 。用P O P G E N E 软件计算各位点基因频率、平均位点A ( a v e r a g en l l l F l 抽l “ o f 跳如) ，有效位点N 。( 0 2 b r l l k l - o f 簖斌妇a l l e l e s ) 、多态位点( p o l y m o r p h i cl o c i ) 、多态位点百分率( p e r c e n t a g eo f 叫y m o q , h i cl o c i ) 、N e i s 基因多
7、样性指数、S h a n n o n s 信息指数、遗传一致度和遗传距离。 2 结果2 1R A P D 扩增结果从1 2 0 个随机引物中筛选出1 0 个能扩增出清晰条带的进行分析，共扩出1 1 0 清晰条带，平均每个引物扩出1 1 条，片段长度从2 0 0 h p 一2 岫0 0 b p 不等，其中多态性条带1 0 6 条， 多态位点百分率为9 6 3 6 。2 2 遗传多样性由P o p g e n e 计算结果得每个位点平均等位基因数n a ( a v e r a g en u m b e ro fa l l e l e s ) 为1 3 5 6 9 、有效位点n e ( 砒ro fq
8、 y e a 讹a l l e l e s ) 为1 2 2 2 2 、N e i 8g e n e t i cd i v e r s i t y ( h ) 为0 2 4 3 2 、S h a n n o n 8I n f o r m a t i o ni n d e x ( I ) 为0 3 8 2 8 。各居群平均多态位点数为3 8 8 ，平均多态位点百分率为3 5 ”( 表略) 。按照多态位点百分率、N e i 8g e n e t i cd i v e r s i t y ( h ) 及S h a n n o n 8I n f o m a a t i o ni n d e x ( I
9、 )排序，居群G Z A 、H B B 、S C D 、S X B 排在前面。2 3 遗传分化使用N e i 指数和S t m n n o n 指数估计杜仲各居群问的遗传分化o 。由N e i si n d e x 估计的总遗传多样性( H t ) 为o 2 3 4 4 ，大于居群内遗传多样性( H s ) 为0 1 2 6 9 ，居群问遗传变异在总遗传变异中所占比例( G s t ) 为o 4 5 8 5 ( 表略) ，表明居群间存在很高的遗传变异，占总遗传变异的4 5 8 5 。 由S h a M n sI n f o r m a t i o ni n d e x 估算的种的遗传多样性(
10、u p ) 为o 3 8 2 8 、居群内遗传多样性为O 2 1 5 3 ，居群内与居群间的分配比例与由N e i 8i n d e x 计算的结果相似，居群内遗传多样性所占比侧( H p o p H s p ) 为O 5 4 8 8 、居群问遗传多样性所占比例( I - I s p H p o p ) ，H , s p 为0 4 5 1 2 ( 表略) 。 2 4 遗传一致度和遗传距离由N e i 3U n b i a s e dM e a s u r e s 得遗传一致度和遗传距离表，可见各居群间遗传一致度值除G Z A 居群外，均在0 8 水平以上，G 2 A 居群除与G Z G 、G
11、Z K 、G 7 5 r , 、G S 、H N 居群遗传一致度值大于0 8 外，与其他各居群均小于0 7 。这一居群多态位点9 1 个，多态位点百分率为8 2 7 3 ，远远高于平均多态位点数3 8 8 及平均多态位点百分率3 5 2 7 。 3 讨论3 1 种内遗传多样性的分析通常认为，某一物种的起源中心具有较高的遗传多样性。我国的秦巴山脉是第三纪冰川运动中大量植物种类的避难所，也使得杜仲这一古老树种保存了下来。陕西、四川、贵州、湖南、湖北等省曾分布有大片野生杜仲林，但由于人类的过度砍伐，野生杜仲已风毛麟角很难找到由定数量个体组成的居群，目前的广泛分布多是由当地野生种源繁殖而来。本实验所用
12、样品多采自栽培居群。栽培种也可能具有较高的遗传多样性。从本实验2 2 统计结果来看，扩增出的1 1 0 条带中，有1 0 6 条具有多态性，多态性百分率为9 6 3 6 ，说明杜仲种内蕴涵了相当高的遗传多样性。这可能与杜仲为严格的雌雄异株、且各大栽培 区多采用种子繁殖有关。各居群平均多态位点数为3 8 8 、平均多态位点百分率为3 5 2 7 ，远低于种水平的多样性，G s t 值为O 4 5 8 5 ，表明各居群之间产生了较大的遗传分化。3 2 备居群遗传多样性比较以多态位点百分率、M 3g e n e i e 出r 3 蚵( h ) 、S h a n n o n 3 晰m d 幽1i n
13、d e x ( I ) 分别对各居群排序，结果均以G Z A 和I - I B B 居群的遗传多样性最高，G s 和G Z K 最低。贵州安顺( G Z A ) 居群处于杜仲原始产地，为三个亚居群组成。从S P S S l 0 0 所得出的聚类图中可 以看出，虽然2 4 个体彼此问的遗传距离较大，但它们仍能首先聚为类。湖北巴东( H B B ) 居群样品主要采自三峡林场及其附近山中，该林场建于1 9 7 0 年，位于杜仲的起源中心，以当地原有野生杜仲繁殖而来，而且所采2 0 个样品中有两个为半野生状态，这可能是其多样性较高的原因。3 3 保护策略的分析同农林牧业的人工栽培品种相比较，药用植物更
14、重要的是质量而不是数量，因此遗传资源的丰富性显得更加重要。虽然很多药用植物不象一般濒危植物那样分布面积狭小，但长期的栽培必然面临等位基因的丢失。杜仲为乔木，生长周期长，人工育苗栽培已成为传统。这种大规模育种，其种子来源很可能极为单一，极易造成遗传背景单一。1 9 8 9 年H a r n r i k 和G o d t 总结1 6 5 个属的遗传多样性资料表明：植物多态位点的遗传变异7 8 发现在居群内，2 2 在居群间。本实验结果：杜仲种内总的多态位点百分率为9 6 3 6 ，各居群的平均值为3 5 2 7 ，遗传分化5 4 1 5 位于居群之内，4 5 8 5 分布在居群问。从遗传多样性保护
15、的角度来说应当对杜仲多个居群的遗传变异进行保护，并促进不同地区种源的交流，避免单一种源的大面积栽培所造成的遗传多样性降低。黄芩种质资源的研究概况孛欣1 ，黄璐琦1 ，邵爱娟1 ，林淑芳1 ，郑鑫2( 1 中国中医研究院中药研究所北京1 0 0 7 0 0 ；2 重庆太极医药研究院重庆4 0 0 0 1 5 )黄芩为唇形科黄芩属植物黄芩S c u t e o A ab a c a e n s s 国。画的干燥根，是我国常用的大宗药材之一。始载于神农本草经，列为中品，其性寒味苦，具有清热燥湿，泻火解毒，止血安胎的作用，为清凉解热药。黄芩在我国的分布主要以北方为主，其中山西产景最多，河北承德质佳。其药材商品可分为子芩、条芩、枯芩、芩片等规格，以子芩者质佳，枯芩质次 1 。黄芩在临床应用的范围较广，对治疗肺炎，肝炎 2 ，慢性支气管炎，高血压，化脓性感染及先兆流产等疾病都有较好的疗效。另外与其它中药合用对治疗上呼吸道2 3
