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1、R N A 靶向干扰用M 基因表达对喉癌H e p 2 细胞生物学行为的影响E f f e c t so ft h eb i o l o g i c a lb e h a v i o ra f t e rs i l e n c i n gP I Nle x p r e s s i o ni nH e p - - 2c e l l sb yu s i n gR N Ai n t e r f e r e n c e二级学科：遂堡鲎论文课题起止时间：2Q ! Q 生三月二2Q12 生垒旦论文完成时间：2Q12 生垒旦中国医科大学( 辽宁)20 12 年5 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申
2、明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：反! 盔车日期：2 2 2 盔殂2 ，日中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作
3、成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：目录一、摘要中文论著摘要”1英文论著摘要4二、英文缩略语”8三、论文前言9 9日U 舌。材料与方法lO实验结果2 3讨论“3 2结论”3 5四、本研究创新性的自我评价3 6五、参考文献3 7六、附录综述”4 0在学期间科研成绩4 7致谢“4 8个人简介4 9中文论著摘要R N A 靶向干扰纠M 基因表达对喉癌
4、H e p 2 细胞生物学行为的影响刖吾喉鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，过去的1 0 年中，我国喉癌的发病率呈现上升的趋势，我国东北是喉癌的高发地区。喉癌对放疗及化疗均不敏感，手术是目l ； 治疗的主要手段，但手术会给患者造成不同程度的损伤。因此实现对喉癌的早期发现、早期诊断，并在基因水平寻找新的治疗手段为当前急待解决的问题。目前，喉癌的发生机制尚不明确，探索喉癌发生机制，将有助于解决喉癌防治的关键问题，因此发现喉癌发生相关基因、探索喉癌发生机制已经成为喉癌研究的热点问题。P I N I 是一种高度保守的、特异的肽基脯氨酰基顺反异构酶，能特异性地催化磷酸化的丝氨酸、苏氨酸脯氨酸基序发生
5、异构，由顺式变为反式，调节底物蛋白。研究表明其过表达与肿瘤发生发展有关，被称为肿瘤发生发展的催化因子。R N A 干扰是转录后水平封闭或沉默相应基因表达的新基因阻断技术，近几年成为基因治疗研究的热点。其原理是小片段R N A 利用碱基互补的原理，特异性地结合癌基因的m R N A 并将其降解，干扰其形成蛋白质的功能，阻抑癌蛋白的生成。使癌细胞向成熟方向分化或诱导细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞恶性增殖的目的。喉癌和其它肿瘤一样，是一种多基因，多步骤，多阶段的发生过程，发病机制复杂，治疗困难。是否可以利用R N A i 技术沉默喉癌细胞中P I N l 基因的表达，以达到阻止或减缓肿瘤细胞生长的目
6、的尚属未知领域。本研究旨在探讨R N A 干扰尸：删基因表达对喉癌H e p - 2 细胞增殖、凋亡、侵袭转移、及中心体扩增等生物学行为影响，探索有效的治疗靶基因、寻找理想的标志物，为喉癌的生物学治疗提供新的分子靶点和理论依据。材料与方法一、实验材料：( 1 ) 喉鳞状细胞癌H e p - 2 细胞系，感受态大肠杆菌J M l 0 9 。( 2 ) 主要分子生物学相关试剂：R P M l l 6 4 0 培养基，胎牛血清，T R l z o l ，脂质体转染试剂盒，T a q 酶，琼脂糖，反转录试剂盒，p S i l e n c e r T M4 1 C M V 质粒，C o n t r o
7、l - s h R N A 载体，鼠抗丫微管蛋白单克隆抗体，兔抗1 3 - A c t i n 蛋白单克隆抗体，兔抗P I N l 蛋白单克隆抗体，辣根酶标记山羊抗兔I g G ，F I T C 标记山羊抗鼠I g G ( 丫微管蛋白特异性) ，Q I A G E N 质粒中量提取试剂盒。二、实验方法1 构建P I N l 基因的重组载体2 应用R T - P C R 方法检测喉癌组织、H e p 2 细胞和H E K 2 9 3 细胞中P I N l 基因m R N A 表达情况。3 用脂质体将重组质粒用M s h R N A 转染H e p - 2 细胞，同时以转染C o n t r o
8、l - s h R N A 载体组和未处理组作为对照。( 分别命名为H e p - 2 p - s h R N A 组、H e p - 2 p C o n 组和H e p 一2 组) 。4 R T - P C R 和W e s t e r nB l o t 检测靶向干扰H e p 2 细胞P I N l 基因后m R N A 和蛋白的表达水平。5 用M s h R N A 转染H e p 2 细胞检测细胞凋亡情况。6 应用M T T 方法检测用M s h R N A 转染H e p - - 2 细胞后细胞的增殖能力的改变。7 免疫荧光法检测细胞转染后中心体的扩增情况。8 应用T r a n s
9、 w e l l 检测删s h R N A 转染H e p 2 细胞后细胞迁移能力的改变。实验结果1 成功构建户舢基因的重组载体。2 R T - P C R 结果显示，喉癌组织删的m R N A 水平明显高于癌旁组织，H e p 2 细胞中删的m R N A 水平明显高于H E K 2 9 3 细胞。3 R T - P C R 和W e s t e r nb l o t 灰度比半定量检测结果显示，特异性尸：，s h R N A转染H e p 2 细胞7 2 h 后m R N A 和蛋白水平与对照组相比明显降低。24 刷Ms h R N A 转染H e p - 2 细胞后与对照组相比，实验组喉癌
10、H e p 一2 细胞的增殖能力和体外侵袭能力显著降低、细胞凋亡率增加。5 中心体异常统计结果：H e p 2 细胞系有明显的中心体扩增，经统计中心体数目变化范围为1 - - 7 个，纠：M s h R N A 转染H e p 一2 细胞后，有中心体异常的细胞数目( 即中心体数目 2 ) 为O 1 明显低于对照组的1 0 “ 2 2 ( p 2 ) 占O l ；经Z 2 检验，p 2淤l234567数目细胞的细胞所。叶H lH 2H 3H 4H 5C lC 2C 3C 4C 5S lS 2s 3s 4S 51 9 81 9 32 1 02 0 51 9 21 7 21 7 41 7 31 7
11、31 8 41 3 61 3 21 3 51 3 81 2 855l220O335ll221lllllO0O000000l000000000OO0ll0l00OlOO000ll1ll0l0OlO0O002l34llO2l20000O屹B 坫托989n 坦BO 0O0400218258360582666564544433333l59672829O4952822l224343466666幽BH e p 2 组图A图Cc o n 组s i 组图D- 1 个中C 水开中, C 4 t- 2 个中心体图8 ，免疫荧光检测中心体的扩增( D A P I 进行细胞核染色) 。图A ：免疫荧光检测并观察H e
12、 p - 2 细胞的中心体；图B ：对照组中心体检测情况；图C ：S i 组中心体检测情况。图D ：中心体扩增细胞统计分析结果。F i g8 ，C e n t r o s o m ea m p l i f i c a t i o nd e t e c t e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c e ( n u c l e iw e r es t a i n e d 、析t I lD A P I )F i gA ：C e n t r o s o m eo fH e p 一2c e l l sw a sd e t e c t e db yi m m u n
13、o f l u o r e s c e n c e ；F i gB ：C e n t r o s o m ed e t e c t i o no ft h ec o n t r o lg r o u p ；F i gC ：C e n t r o s o m ed e t e c t i o no fS ig r o u pF i gD ：S t a t i s t i c sa n a l y s i sr e s u l t so fc e n t r o s o m ea m p l i f i c a t i o n 6 、转染后细胞侵袭能力检测结果：尸删特异性s I 武N A 重组质粒
14、转染H e p - 2 细胞后，使H e p 一2 细胞侵袭能力受到显著的抑制，H e p 2 p - s h I A 组侵袭- 卒_ T r a n s w e l l t b 室滤膜下表面的细胞数为3 8 0 0 士2 3 5 ，明显低于H e p 2 组的7 9 0 0 j ：5 2 6 和H e p 一2 p - C o n 鲑t 的7 3 0 0 j ：2 31 ，经统计学分析，实验组与对照组差异显著( 刚0 5 ) 。H1 2 0I O OOOO2 0O图A眦侵袭诧力检测c o r a lI I 丑分组 图B 图9 ，特异性干舢，基因，H e p - 2 细胞侵袭能力检测。图A ：细胞侵袭能力检测结果；图B ：三次独立实验统计学分析。H ：空白对照组；C ：阴性对照组；S ：s h R N A 转染实验组。F i 9 9 ，D e t e c t i o no fH e p - 2c e l l si n v a s i o na b i l i t ya f t e rs p e c i f i ci n t e r f e r e n c eP I N1g e n e 3 l焱詈癸钕F i g A ，D e t e c t
