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1、浙江大学硕士学位论文Iressa（ZD1839）对肺癌A549细胞系的放射增效作用姓名：许亚萍申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：魏启春20060301I r e s s a ( z D l 8 3 9 ) 对肺癌A 5 4 9 纲胞系的放射增效作用浙江大学医学院肿瘤学2 0 0 2 级阕等学历申请硕士学位人员许亚薄导师魏启春中文摘要生长因子调控细胞的增整和分化，在促进和维持纲胞肿瘸性转化方谣超着耋要的作用。汪经证明生长因子和其受体一表皮生长因子受体( E G F R ) 与大部分上皮性肿瘤的发生、发嶷有关。E G F R 激瀵不仅在细胞的增殖、分纯方面趋着踅要的作用，而且E G 滁介导的
2、信号传导通路在癌症进展方面也起餐重要的作用，包括促进肿瘤血管形成、肿瘤转移幂蟊抑制肿瘤纲脆凋亡等。蕈克隆抗体以及与酪氮酸激酶相关的小分子抑制剂，有阻断表皮生长因子受体的功能，尤其是对H E R 2 n e u 和E G 舔，不管是体内还是体外试验都对人类肿瘤有显著的抗肿瘤作用。E G F R 的高表达与肿瘤对激素治疗、细胞毒药物治疗积放射治疗的抗拒有关。临床前期试验蠢经证实E G F R 的高表达与肿瘤细胞对电离辐射的敏感性下降有关。电离辐射治疗通过释放转化生长因子( T d ) 和激活表皮生长因子受体一酪氨酸激酶( E G F R T K ) 而诱导E G F R r a s r a f M
3、 A P K 细胞增殪通路，E G F R 激遗能使暴露在细胞毒损伤中的癌缁胞阻断细胞捅亡信号，从而使临床上一些癌细胞能逃避辐射诱发的细胞死亡。I r e s s a 是一对口服起效蛇小分子表皮生长因子受体一酪氨酸激酶抑制剂( E G F R T K I ) ，已在多个国家获准上市，用于治疗化疗失黢的晚翅； 小缨熊肺癌。最近，E G F R T K I 联合放射治疗N S C L c 靛一些临床试验也已经糍开展。但E G F f 一羊 ( I 联合放射治疗N S e L C 是否起到协阍作用，机理如何，尚不清楚。本研究主要观察I r e 8 s a 在体外对人肺艨癞A 5 4 9 细胞系的放射
4、增效作用，以此探索E G F R T K I 联合放射治疗瓣S C K 静疗效及蜀鑫毫枫瑾，蔻晦床爵找有效鲍以E G 弑为靶点戆瓣瘤治疗方法提供实验依据。圈的：研究分子靶向药物I r e s s a ( Z D l 8 3 9 ) 在体外对人肺腺癌A 5 4 9缯耱系躲藏装增效 每矮。方法：鼹霉法梭潦I r e s s 鑫草药霹I r e s s 8 联合6 oY 射线照射对A 5 4 9 细胞的抑制率；细胞缀1 5 g m 1 的I r e s s a 作用7 2 h 后分为4 组：对照组( C 组) 、I r e s s a 组( I 组) 、放射组( R 组) 、I r e s s a
5、+放射缎( + R 组) ，分鄹进行培养瓶克隆形成搴溪l 定、流式纲腮术分析”e 。照射君2 4 、4 8 h 各组绸胞瘸期和凋亡率燮化。结果：弼T T 结果显示A 5 哇9细胞的抑制率与I r e s s a 浓度成正相关，I r e s s a 处理4 8 hI C 5 0 = 4 9 8 8ug m 】。当I r e s s a 浓度为5 、l O 、1 5 、2 0 、3 0 、4 0pg m l 时，能增强。C o照射对A 5 4 9 缅魔豹辫镧率。各组壤葬簸克隧形成率分别怒e 缝ll 。9 7 2 8 2 、I 组7 4 3 0 5 8 、R 组1 5 5 O 5 、I 十R 组O
6、 5 7 0 1 5 ，提示I r e s s a 本身可抑制A 5 4 9 细胞增疆，与6 。C 。v 射线照射联合能增强放射抑铡A S 硅9 缀您熬效果。流式蹋憝术分析萎示1 5 彗g 屈l 熬I r e s s 8 处理? 2 h ，A 5 4 9 细胞周期中的岛一G 。期细胞比例明显升高，从6 7 5 1 2 5 6 上升到7 3 6 3 1 6 2 ；G ：一M 期细胞比例从8 3 9 0 6 1 下降到7 0 2 1 1 ；s期毙铡从2 1 2 6 S 下降到1 9 3 6 1 6 3 ；凋亡率从0 9 9 O 5 6 上升到1 9 5 O 7 蕊( p 流式细胞仪( 美国B D
7、公司F A c SC a l i b u r ，B e c t o nD i e k i n s o n 公司照射条件：6 。c o 治疗机Y 射线照射，吸收剂量率1 2 2 0 9 c G y m i n ，S S 转= 8 0 0 珏l ，龛雪娶2 0 2 0 e 蠢，鼹射裁耋嚣篷y 。( 二) 方法1 M T T 法测I r e s s 8 对A 5 4 9 细胞的抑制率对数生长袭的A 5 鹳细魏，捌成单细麓悬液，按每孔5 1 0 3 个接种子块9 6 孔扳。培蓁莲8 h ，每孔热入食I r e s 8 a 浓度分瓢为O 、l 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0
8、、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0ug m l 的培养液1 0 0ul ，每组设8 个复孔，继续培养4 8 h 厝，每孔加入5 m g m lM T T1 5 u 1 ，再培养4 h ，吸去上液，每孔加入酸纯辩丙醇1 0 0 扛l ，静置3 0 疆i n ，待孔底褐色结熬完全溶解，酶标仪梭测5 5 0 n m 处务孔吸光度蕊0 D 。诗算各缌缨胞抑制率。A 5 4 9 细胞抑制率= 1 0 0 对照组吸光值( A ) 实验组吸光值( A ) 对照组吸光值( A ) 。2 。湃茁法测I r e s s 氇孵育7 2 h 后。e o 照葑手对A 5 4 9 细靡的捧铡率A 5 4 9 缀悲
9、按簿孔3 1 0 3 个接释子二块9 6 魏板，壤养2 强，每孔加入含I r e s s a 浓度分别为0 、1 、5 、l O 、1 5 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0ug m l 的培养液1 0 0p1 ，每组设8 个复孔。继续培养7 2 h ，随机取其中一块弱孔板，予8 e oY 射线照隽于贸8 G y ，二块9 6 孔板均褥臻养7 2 h ，誊规鹾T l 法测O D 。，计爨细胞抑制率( 方法阉上) 。并在加入不同浓度的I r e s s a 作用后2 4 l 、4 8 h 、7 2 h ，倒置显微镜下观察各组细胞的形态变化，拍摄照片记录。3 1 器# g
10、m l r e s s a 联合耱c o Y 射线照射对躺4 9 细魏豹影褊焱5 4 9 细胞按2 1 0 4 瓶接穗子2 8 个培蓁瓶。培养2 4 h 缨胞贴壁后随机平均分成4 组：对照组( C 组) 、I r o s s a 组( I 组) 、放射组( R 组) 、I r e s s a + 放射组( I + R 组) 。I 组和I 十R 组加入含1 5ug m lI r e s 8 a 的培养液，其余组燹换新鲜培养液。继续培养7 2 1 ，R 组、I + R 组予8 C 。治疗机Y 射线照射，吸收剂量率1 2 2 0 9 c G y m i n ，s s D = 8 0 c m ，射野2
11、 02 0 c 歉2 ，照射剂量D l6 G y 。培养瓶克隧形成率测定：经”C o 照射后，每组各取1 瓶细胞消化，制成单细胞悬液，每组分别接秣3 瓶，每瓶l 1 0 3 个细胞。继续培养至瓶底长嫩肉眼可见的自色克隆，去塘养液，每瓶翔入争醇5 氇l 瓣定1 5 珏l i n ，吉姆萨粢色3 0 强i n ，流水冲洗，自然干燥詹，肉眼计数每瓶克隆数。克隆形成率= 克隆数接种的细胞数1 0 0 。( 2 ) 饲差显畿镶蕊察8 8 e o 照射嚣缨胞形态交纯”C 。照射结束后，每隔2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 饲置显微镜下溉察各组细胞的形态变化，并拍摄照片记录。( 3 ) 流式细臆拳淤备
12、组A 5 4 9 缨胞妁缨麓周期翱凋亡率8 。C o 照射后2 4 、4 8h ，每缓取2 勰细施消化磊，移入离心管，l 0 0 0 r p m离心6 m i n ，去上液，p B S 液洗2 次( 每次加3 m l P B s 液，鼹荡后离心) ，去上液，将沉淀下来的纲胞用7 5 酒精阑定2 4 小时以上( 4 保存)1 5 r p m 离心5 1 鞋i n 嚣去上滚，再臻s 滚洗2 次，去上液。鞠公司旗讫丙锭试剂盒染色，加A 液1 2 5p1 管，l O m i n ，加B 液1 0 0u1 管，1 0 m i n ，加e 液1 0 0Hl 管，略震荡，避光3 0 m i n ，流式细胞仪
13、检测细胞周期和璃亡率。4 统计学方法各组数据使用S P S S l1 O 软件包进行统计分析。计量资料用均数标准熬表示，两样本均数比较用t 检验；在检验方差齐性的条件下，多组阏均数鲍较爝方装分析，F 检验。均数闻两两比较用琏检验( N e 嬲a n K e u l s 法) 法检验。均以P O 0 5 ) ；当I r e s s a 浓度= 4 0ug m l 时( P = 0 0 4 8 ) ；当I r e s s a 浓度= 5 0 1 0 0ug m 1 ( P O 0 5 ) ；I r e s s a + 放疗组凋亡率较其它组赢( p ，耍测入中位生存时阕分剃为5 。2 个嚣帮5 1
14、个月( 尸= O 2 9 4 ) 。I S E L 的研究结果鼹示，I r e s s a 能改蒋晚期非小细胞肺癞的生存，但无统计学意义。亚组分析显示，I r e s s a 能明显改善非吸烟患者和亚洲患者的生存。2 4I r e s s a 作为嚣小细胞肺癌的维持治疗用药s w 0 GS 0 0 2 3 研究阻3 是在S W O G 标准盼局部晚期非小纲胞肺癌化放疗方案的基础上使用I r e s s a 维持治疗的一项临床试验。6 7 2 例患者入蠢。醭究方案为先嚣P 方案 C D D P5 0 瓣咖2d l ，8 ，2 9 ，3 6 ；V P 1 65 0 毽g 勉2d 1 5 ，2 9
15、- 3 3 ) 和放疗同步进行，然后多西他赛7 5 m g m 2 d 3 w 巩阉化疗共3 阆糍，褥随机分为I r e s s a 治疗组( 2 5 0 m g ，d ，5 0 0 m g d ) 帮安愆帮组宜至疾病进鼹。两组中位无进展生存对闻分别为1 1 个月和l O 个胃( 尸= o 5 4 ) ，中位总生存时间分别为1 9 个月和2 9 个月( 肛O ，0 9 ) 。l 掩s s a 2 5 0 搬酬组耱l 辖s s 鑫5 0 0 m g 惩组蕊孛位总生存眩阙分剽为1 8 个月和1 9 个月。s w 0 G S 0 0 2 3 的结果显示，I r e s s a 与放化疗联合治疗不提高
16、菲，j 、细胞肺癌的生存，甚至可能有负性作用。3I r e s s a 在非小绑胞肺癌治疗中的疗效反应预测I r e s s a 治疗约可使1 0 的非小细胞肺癌患者的肿瘸缩小。到底哪些惑者是“有利型”患者，懿何使治疗更毒针对滢戳达到治疗个体纯熬目的，肿瘸学家对此作了很多研究。3 1l r e s s a 的药效学与药动学对疗效的影确关于l r e s s a 影响癌症患者表皮生长因子受体酪氨酸激酶效能的药效动力学临床试验已经被评估，I 期和I I 期临床试验均提示皮肤表皮生长嚣子受体酪氨酸激酶麴表达可以l 耍示嚣G F R 酪氮酸逶爨是否被嫩断；是否出现皮疹可以预测I r e s s a 临床治疗的疗划8 剐。除了测定E G F R ，E G F R 信号传导通路上下游分子亦可以作为标记物测定，例如，经I
