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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 鸿，李顺乐 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院普外科，陕西西安 710004【摘要】 目的 探讨大鼠肝缺血再灌注(I/R)对胆小管纤维形肌动蛋白(Factin)微丝的影响。方法 采用肝缺血 35min 再灌注模型，检测血清中 ALT、AST、GGT 和 TBIL 的含量;电镜观察胆小管的变化;异硫氢胍荧光素标记的鬼笔环肽(FITCPhalloidin)显示胆小管 Factin 微丝的分布变化，激光共聚焦显微镜采集图像并定量分析。结果 Factin 微丝荧光变化和电镜超微结构的改变相符合，Factin 的荧光染色再灌注前正常，而再灌注后明显减弱;胆
2、小管微绒毛再灌注前没有消失，而再灌注后却大量脱落。这与血清 GGT和 TBIL 的异常改变一致。结论 再灌注而非缺血可造成胆小管Factin 微丝破坏、微绒毛丧失，导致胆小管收缩减弱，胆汁排泄功能受损。这可能是大鼠肝 I/R 后胆汁淤积发生的主要机制。【关键词】 肝缺血再灌注;胆汁淤积;纤维形肌动蛋白 Factin microfilaments in rat liverLI Yiming, LIU Jidong, JI Hong, LI Shunle(Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital,Medical Sc
3、hool of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effect of hepatic KKME-专业医学搜索引擎 http:/ bile canalicular Factin microfilaments in rat. Methods A model of rat hepatic ischemiareperfusion was adopted and the ischemia time was 35min. The levels of serum ALT, A
4、ST, GGT, and TBIL were measured. The changes of bile canaliculus were observed by transmission electron microscope. The modification of Factin microfilaments was quantified by using FITCPhalloidin and analyzed by confocal laser scanning microscopy imaging. Results This modification of Factin stainin
5、g was consistent with the observation by transmission electron microscopy. The staining of Factin was normal in hepatocytes before reperfusion, but decreased significantly after reperfusion, and there was a marked loss of canalicular microvilli after reperfusion, which were in coincidence with abnor
6、mality of serum GGT and TBIL. Conclusion Reperfusion not ischemia induced disruption of Factin microfilaments and a loss of microvilli, and these modifications could lead to impaired bile excretion by damaging canalicular contraction, which maybe the main mechanism of cholestasis after rat hepatic i
7、schemiareperfusion.KEY WORDS: hepatic ischemia reperfusion; cholestasis; Factin肝脏缺血再灌注后常有胆汁淤积的发生13，其机制尚未完全了解。Factin 微丝沿质膜分布，尤其在胆小管区域，它对胆小管收缩引起胆汁排泄起重要作用4。目前，国内尚无对肝缺血KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Factin 微丝变化的研究报道。本实验通过异硫氢胍荧光素标记的鬼笔环肽显示大鼠肝脏胆小管 Factin 微丝在经历缺血再灌注后的变化，用激光共聚焦显微镜采集图像并定量分析，以期探讨上述胆汁淤积发生的机制。1 材料与方法1.1 材
8、料 雄性 SD 大鼠 36 只，体重 200250g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。异硫氢胍荧光素标记的鬼笔环肽(FITCPhalloidin)和抗荧光衰减封片剂均购自 Alexis 公司。日立HITACHI 公司 H600 透射式电子显微镜由西安交通大学医学院电子显微镜中心提供。激光共聚焦显微镜(型号：TCS Sp2)由西安交通大学医学院中心实验室提供。1.2 实验分组 36 只大鼠随机分成 6 组，每组 6 只。对照组：术中只开腹解剖肝门，不做肝门阻断及再灌注，直接取材。 缺血组：肝门阻断 35min，不做再灌注。I/R 2h 组：肝门阻断35min，再灌注 2h。I/R 6h 组
9、：肝门阻断 35min，再灌注 6h。 I/R 24h 组：肝门阻断 35min，再灌注 24h。I/R 48h 组：肝门阻断35min，再灌注 48h。1.3 动物模型及取材 大鼠术前 12h 禁食，自由饮水。戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，取上腹正中切口入腹，游离肝蒂，用无创血管夹夹闭，造成 100%实质性肝缺血，持续时间为 35min，后去除血管夹，形成再灌注。至预定时点取材，心腔采血，制备血清。迅速切取肝脏组织，部分低温下细切为 1mm3 大小，20g/L 戊KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Factin 检测;部分置 100mL/L 甲醛保存。1.4 血清学指标的测
10、定 主要检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷氨酰转肽酶(glutamyl transferase, GGT)和总胆红素(total bilirubin, TBIL)。其步骤为：心腔采血，常温下凝固后离心，取血清送本院检验科，用 7600 型全自动生化分析仪测定。1.5 病理学检查 肝组织石蜡标本行 HE 染色，光镜下观察肝组织的病理改变，透射电镜观察胆小管超微结构的改变。1.6 Factin 的检测5 将-80冰箱保存的肝脏组织于低温切片机(-28)下切
11、成 8m 厚的冰冻切片;PBS 简单冲洗、晾干，用 37g/L 的多聚甲醛于室温下固定 10min，PBS 洗 3 次;以下步骤避光操作：滴加 FITCPhalloidin 染色液(甲醇溶解，PBS 稀释至10mg/L)，室温孵化 1h，PBS 冲洗 3 次，每次 15min，洗去多余荧光;抗荧光衰减封片剂封片;于激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，测定胆小管膜平均特异的荧光强度。1.7 统计学处理 实验数据采用均数标准差表示，用SPSS13.0 统计软件处理，各组间比较用方差分析、Dunnettt 检验，组间方差不齐时采用非参数秩和检验，P0.05);再灌注 248h 后，各组和对照组相比均有
12、显著性差异(P0.05，图 3)。3 讨 论纤维形肌动蛋白(Factin)是由单体球形肌动蛋白(Gactin)依赖 ATP 装配而成的，是细胞骨架结构的主要组成部分。TSUKADA 等6发现胆小管微绒毛包含有许多 Factin 微丝束。这些微丝从质膜延伸至管腔共同构成胆小管微绒毛的内芯。胆小管是胆汁排泄的最小管道,它在胆汁分泌过程中起着重要作用6。胆汁在肝内的排泄依赖于胆小管的收缩。而位于汇管区周围的胆小管连续、有力、单向的收缩运动，可有效地将胆汁推向肝门部的胆管。研究表明，Factin 微丝连续地聚合与解聚作用实现胆小管的收缩，进而促进胆汁排泄7。业已证明，改变 Factin 微丝结构，将破
13、坏胆小管收缩，从而导致胆汁淤积8。各种肝门阻断手术、休克、肝移植术后早期常出现胆汁淤积1,3。有国外学者报道此时肝细胞对胆汁的分泌功能并无显著变化23。因此，从临床角度出发，了解Factin 微丝异常变化对肝缺血再灌注后胆汁淤积的发生机制具有重要的理论意义。从本实验可见，血清 ALT 和 AST 水平，于再灌注 6h 达最高，随后下降;与此相反，血清 GGT 和 TBIL 水平各组间呈持续升高趋势。这说明肝脏经历轻度热缺血再灌注损伤后，肝细胞发生可逆性损伤，并出现胆汁淤积;随着受损肝细胞的逐渐恢复，胆汁淤积仍KKME-专业医学搜索引擎 http:/ ALT 和 AST 水平很快达到高峰，随后便
14、迅速下降;而血清 GGT 和 TBIL 水平却持续上升，两周左右才达到高峰1,3。这也说明肝脏经历缺血再灌注后一定时期内存在胆汁淤积。同时，本实验的肝组织病理学检查也证实，大鼠全肝缺血 35min 再灌注模型炎症反应较轻，仅有少许肝细胞坏死，这样就避免了因肝细胞大量坏死造成的胆汁淤积和对 Factin 的潜在影响。我们的实验结果显示：荧光变化和电镜超微结构改变相符，再灌注 248h，Factin 荧光染色紊乱、减弱，强度明显低于对照组;胆小管微绒毛大量脱落。热缺血 35min 后，Factin 荧光染色与对照组比较无明显变化，胆小管微绒毛没有消失。以上结果与再灌注后血清 GGT 和 TBIL
15、的异常改变相一致。这充分说明：鼠肝缺血再灌注后 Factin 微丝破坏、细胞骨架崩解导致胆小管收缩功能受损，胆汁排泄障碍，从而导致胆汁淤积;胆小管 Factin 微丝对再灌注损伤非常敏感，而对单纯的短期(35min)热缺血反应不敏感。BENKOEL 等5发现，肝移植术后再灌注早期，胆小管膜 Factin的荧光染色与对照组相比减少了 25%，而在冷缺血末期，Factin的荧光染色与对照组相似;CUTRIN 等1证实肝移植术后再灌注早期胆小管微绒毛大量丧失，其改变与经细胞松弛素 B 灌注后的肝脏胆小管、微绒毛相似，冷缺血末期胆小管内微绒毛无显著变化。这与我们的实验结果相似。Factin 微丝于再灌注之后的这种改变可能是活性氧(ROS)KKME-专业医学搜索引擎 http:/ PKC 所介导的，而非直接的氧化作用，氧化
