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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 胡 涛审校 作者单位：口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学 四川 成都 610041【摘要】 果糖基转移酶是口腔细菌细胞外多糖合成酶之一，它以蔗糖为底物催化合成果聚糖。口腔链球菌果糖基转移酶是口腔重要的致龋蛋白之一。笔者下面就果糖基转移酶的分子结构、反应机制和编码基因及其调节作一综述。【关键词】 果糖基转移酶； 果聚糖； 分子结构； 反应机制AMolecular structure and regulation mechanism of fructosyltransferase in oral Streptococci QIU Yuan-xin, HU
2、 Tao. （State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China）Abstract Fructosyltransferase is a kind of enzyme, which catalyzes the synthesis of fructan when sucrose is present at environment. The fructosyltransferase of oral Streptococci acts as one of its important cario
3、genic proteins. The article reviewed the molecular structure, reaction mechanism, coding gene and regulation mechanism of fructosyltransferase.Key words fructosyltransferase； fructan； molecular structure； regulation mechanismKKME-专业医学搜索引擎 http:/ mutans，S.mutans） 、唾液链球菌（Streptococcus salivarius，S. sa
4、livarius）和黏性放线菌（Actinomyces viscosus，A.viscosus）等产生3。FTF 和芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）的果聚糖蔗糖酶组成了一个酶家族，包括合成左旋糖酐的左旋糖蔗糖酶（levansucrase）和合成菊粉型果聚糖的菊粉蔗糖酶（inulosucrase） 。芽孢杆菌和变异链球菌的 FTF直接分泌到培养液中，而唾液链球菌4的 FTF 最初以细胞结合的形式存在，当其底物（蔗糖）存在时，结合的 FTF 就会释放到培养基中。1 果糖基转移酶的分子结构FTF 的分子结构由信号肽、N 端可变区、催化核心区、C端可变区（有时含胞
5、壁结合域）组成。1.1 信号肽和 N 端可变区Shiroza 等5在对变异链球菌 GS-5 的 FTF 氨基酸分析中发现，FTF 起始部有一长的信号肽序列（前 34 个氨基酸残基） ，其中前 14 个氨基酸高度保守，其后紧接一高度疏水区。信号肽的作用在于该酶的细胞外分泌，革兰阴性细菌的信号肽前体在分泌的过程中被剪切掉。不同细菌的 N 端可变区大小不同，目前的研究认为其作用不大。1.2 催化核心区KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 催化残基 催化核心区是由 5 个折叠的 -螺旋组成中心带负电荷的袋状结构，主要由高度保守的氨基酸残基组成，包括一些不变的酸性氨基酸，例如 86 和 247 位的
6、天冬氨酸（aspartic acid，Asp）及 342 位的谷氨酸。1.2.2 催化位点 对底物具有剪切作用的酶结构位于11 亚位点之间，酶的1 位点和剪切下的底物共价结合形成酶-底物中间体，之后底物与酶解离并与受体分子（如果聚糖）结合。1 位点的氨基酸组成相对保守，而1 位点的氨基酸组成则变化较大，且革兰阳性和革兰阴性细菌的 FTF 分子的1 位点的氨基酸组成不同。1.2.3 影响产物形成的突变 催化核心区的数个保守的氨基酸残基对 FTF 的功能至关重要，FTF 的 2 个高度保守区被称为蔗糖结合盒（sucrose binding box，SBB） 。唾液链球菌 ATCC 25975 的F
7、TF 的 SBB-1 和 SBB-2 之间的 Asp312 参与受体识别或 -转角的稳定。发生于 SBB 的点突变导致 FTF 的催化效率明显改变5。芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的第 331 位精氨酸（arginine，Arg）突变导致FTF 活性的变化，如果该氨基酸被赖氨酸、丝氨酸和亮氨酸中的任何一个取代，将使 FTF 失去合成果聚糖的能力而只能合成蔗果三糖。Yanase 等6通过对芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的三维结构分析发现，该酶第 331 位氨基酸残基 Arg 参与构成 FTF 的受体结合位点。1.2.4 钙结合位点 Meng 等7通过对芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的三维结构的分析还发现，该三维结构存在着钙离
8、子结合位点，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Asp339 是钙离子结合残基之一。唾液链球菌 ATCC 25975 的果聚糖蔗糖酶活性也有赖于钙离子的存在8。革兰阳性细菌的果糖基转移酶钙离子结合位点的氨基酸高度保守，在革兰阴性细菌中则没有这样的结构9。1.3 C 端可变区C 端可变区会影响酶产物的大小和酶的特异性，也可介导FTF 吸附于相应的菌体表面。产生这一作用的原因，是该区含有细胞壁结合基序 LPXTG。在唾液链球菌 ATCC 25975 的果聚糖蔗糖酶中，同样存在着类似的结构10。吸附于细菌表面的 FTF 合成的吸附性多糖参与细菌对牙面的黏附11。2 果糖基转移酶的反应机制细菌
9、FTF 水解蔗糖（底物）的糖苷键，并利用其释放的能量将游离的果糖偶联至相应的受体上，这些受体包括正在延长的左旋糖酐或菊粉等果聚糖链、蔗糖和水及其他（如棉子糖） 。由于蔗糖是初始活化反应的受体，因此细菌果聚糖在链的一端含有一个非还原葡萄糖。FTF 催化合成新的果聚糖分子，后者又可以作为该反应的底物受体。因此，有学者提出了多链延长机制12：在该反应中，果糖残基随机加入所有的果聚糖受体分子中，不包括水的果糖基受体的性质随反应的进行而变化，合成的低分子质量的果聚糖会加速多糖的形成并增加果聚糖或游离果糖的比例13；在进一步的反应中，一个果糖单位加入到一个受体分子中。大多数 FTF 的水解和转KKME-专
10、业医学搜索引擎 http:/ 与底物共价结合形成酶-底物中间体；之后，底物与 FTF 解离并与果聚糖等受体分子结合。FTF 的酸性基团和亲核基团为转果糖基反应的必须基团。其中，亲核基团和果糖结合形成底物-酶中间体。Steinberg等14发现，变异链球菌 FTF 的聚合活性和寡聚活性的调节方式不同，推测其反应机制可能涉及 2 个活性位点。3 ftf 基因及其表达调控FTF 由单一 ftf 基因编码。Shiroza 等5在对变异链球菌GS-5 的 ftf 基因序列分析中发现，GS-5 的结构基因始于第 681 位的起始密码子 ATG，止于第 3 072 位的终止密码子 TAA；GS-5 的完整基
11、因编码 797 个氨基酸的蛋白质，推测其相对分子质量为8.76104。ftf 基因上游有 471518 位和 565593 位两段反向重复序列，可能是其调节区。Kiska 等15发现，这两个反向重复序列之间的基因缺失会导致 ftf 基因转录水平下降 40%，在 ftf 基因617645 位的上游还存在着一启动子样的序列，即 ATGATA-N17-TAGGAT，该序列类似于大肠杆菌的共有序列 TTGACA-N17-TATAAT。在 ftf 基因下游 3 1503 179 位也存在的一反向重复结构，可能是 ftf 基因的转录终止子。对 FTF 高产菌株变异链球菌 V-403的基因序列分析表明，其基
12、因上游的数个核酸序列改变是导致其产生较多 FTF 的原因。Shiroza 等5在变异链球菌 GS-5 的 FTF 结构基因的两侧还检测出 4 个开放读码框（ORF14） 。其中，ORF1 和 ORF2 位于 ftfKKME-专业医学搜索引擎 http:/ 和 ORF4 位于其下游。与其他 ORF 不同的是，ORF3 又名 frp 基因，其转录方向与 ftf 基因的转录方向相反，起始于 3 951 位的 ATG，终止于 3 267 位的 TAA，编码一种 228 个氨基酸、相对分子质量为 2.65104 的多肽，在其前方35 和10处有启动子序列（TTGCAA 和 TATAAA） 。在3 956
13、 位存在一潜在的 S-D 序列，与 3 958 至 3 978 位的反向重复序列部分重叠，提示该反向重复序列可能参与调节 ORF3 的表达。frp 基因产物的部分氨基酸序列与革兰阳性细菌的 DNA 结合蛋白-37 亚单位、SpoOF、PhoP 和 PenI 等蛋白具有一定的同源性，因此推测其可能参与 FTF 的表达调节。Shibata 等16发现，frp 基因的编码蛋白 FRP 特异性地与 ftf 基因启动子上游 565593 位的反向重复序列结合，从而可能调节 FTF 的表达。Wang 等17在进一步研究中发现，FRP 蛋白正向调节 FTF 的表达，变异链球菌 GS-5 的 frp基因失活株
14、的 ftf 基因转录、FTF 表达及其活性均下降。此外，FRP还可正向调节葡糖基转移酶（glucosyl transferase，gtf）B 基因的转录表达和 GtfB 的活性。除 FRP 之外，VicRK 双组分信号转导系统、RegM 蛋白和糖磷酸转移酶运送系统（phosphotra-nsferase transport system，PTS）均参与调节 ftf 基因的表达。VicRK 系统由位于细菌细胞膜上的组氨酸激酶感受器 VicK 和位于细胞质中的调节器 VicR 组成，其中VicK 感知环境变化，VicR 调节基因表达。VicRK 由操纵子 vicRKX编码，其中 vicR 编码调节
15、蛋白 VicR，vicK 编码感受蛋白KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 编码 VicX。Lee 等18应用抗 FTF 抗体探针检测到 covR 突变株的 FTF表达水平为野生株的 3 倍，从而认为 CovRS（即 VicRK）负向调节FTF 的表达且其作用发生在 ftf 基因转录水平。Senadheera 等19则认为，VicRK 正性调节 ftf 的表达，变异链球菌 UA159 的 vicK 突变株（SmuvicK）的 ftf 基因表达降低，而其 vicRKX 过表达株（Smuvic+）的 ftf 基因表达明显上升。他们认为，这一作用是通过VicR 与 ftf 启动子区结合来实现的。RegM 是变异链球菌调节蛋白家族成员之一，与其他革兰阳性细菌如芽孢杆菌的代谢物控制蛋白（catabolite control protein，Ccp）-A 属同一家族。Browngardt 等20
