冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)

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1、 1冻干乙型脑炎灭活疫苗（冻干乙型脑炎灭活疫苗（VeroVero 细胞）细胞）DongganDonggan YixingYixing NaoyanNaoyan MiehuoyimiaoMiehuoyimiao (Vero(Vero Xibao)Xibao)JapaneseJapanese EncephalitisEncephalitis VaccineVaccine（VeroVero CellCell） ，Inactivated,Inactivated, Freeze-Freeze-drieddried本品系用乙型脑炎(以下简称乙脑)病毒接种于 Vero 细胞, 经培养、收获病毒液、灭活病毒、

2、浓缩、纯化后，加入稳定剂冻干制成，用于预防乙脑。1.1. 基本要求基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合 “凡例”有关要求。2.2. 制造制造2.1 生产用细胞生产用细胞为 Vero 细胞。2.1.1 细胞库的管理及检定应符合 “生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。各种子批代次应不超过批准的限定代次，取自同批工作细胞库的 1 支或多支细胞管，经复苏、扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。2.1.2 细胞制备取工作细胞库中的 1 支或多支细胞管，细胞复苏、 扩增至接种病毒的细胞为 1 批。将复苏后的单层细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化， 分散成均匀的

3、细胞，加入适宜的培养液混合均匀，置 3537培养形成致密单层细胞。2.2 毒种2.2.1 名称及来源生产用毒种为乙脑病毒 P3株。2.2.2 种子批的建立应符合 “生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。乙脑病毒 P3株原始种子应不超过第 53 代， 主种子批和工作种子批的代次应不超过批准的限定代次。22.2.3 种子批毒种的检定主种子批应进行如下全面检定，工作种子批至少应进行 2.2.3.1-2.2.3.5 项检定。2.2.3.1 鉴别试验将毒种 10 倍系列稀释，取 10-110-5稀释度的病毒液与乙脑特异性免疫血清等量混合作为试验组，取 10-410-8稀释度的病毒液与乙型脑炎非特异性血

4、清等量混合作为对照组，于 37水浴中和 90 分钟，试验组和对照组每个稀释度分别接种体重为 7-9g 昆明鼠或其他品系小鼠 20 只，每只脑内注射 0.03ml，逐日观察，3 日内死亡不计，观察 14 天，计算中和指数应不低于 500。2.2.3.2 无菌检查依法检查（附录 XII A） ，应符合规定。2.2.3.3 支原体检查依法检查（附录 XII B） ，应符合规定。2.2.3.4 病毒滴定将毒种 10 倍系列稀释，取 10-610-9稀释度病毒液脑内接种体重为 79g 昆明鼠或其他品系小鼠，每稀释度注射小鼠 4 只，每只 0.03ml，逐日观察，3 日内死亡者不计，观察 14 天，病毒滴

5、度应不低于 8.0 Lg LD50/ml。2.2.3.5 病毒外源因子检查依法检查（附录 XII C） ，应符合规定。2.2.3.6 免疫原性检查用主种子批毒种制备原疫苗，腹腔免疫体重为 1214g NIH 小鼠 10 只，每只0.3ml，免疫 2 次，间隔 7 天，初免后第 14 天， 对免疫组和未经免疫的对照组小鼠用不低于 10 000 LD50病毒量的非生产用乙脑病毒 P3株进行腹腔攻击，同时各组小鼠每只脑腔注射 0.03ml 稀释液。21 天后免疫组应 100%保护，对照组死亡率应不低于 80%。2.2.4 毒种保存冻干毒种保存于-20以下，液体毒种保存于- 60以下。2.3 原液2.

6、3.1 细胞制备按 2.1.2 项进行。2.3.2 培养液3培养液为含有适宜浓度灭能新生牛血清的 199 或其他适宜培养液。新生牛血清的质量应符合要求（附录 XIII D） ，且乙脑抗体应为阴性。2.3.3 对照细胞病毒外源因子检查依法检查（附录 XII C） ，应符合规定。2.3.4 病毒接种和培养细胞生长成致密单层时，弃去细胞培养液，用 Earles 液或其他适宜的洗涤液充分冲洗细胞,除去牛血清后,加入 MEM 维持液。工作种子批毒种按 0.050.3MOI 接种（同一批工作种子批应按同一 MOI 接种） 。 置适宜温度下培养。2.3.5 病毒收获经培养 60-84 小时，澄清过滤后收获病

7、毒液。根据细胞生长情况，可加入新鲜维持液继续培养， 进行多次病毒收获。同一细胞批的同一次病毒收获液检定合格后可合并为单次病毒收获液。2.3.6 单次病毒收获液检定按 3.1 项进行。2.3.7 病毒灭活应在规定的蛋白质含量范围内进行病毒灭活。单次病毒收获液中加入终浓度为200ug/ml 甲醛，置适宜温度灭活一定时间。病毒灭活到期后，每个病毒灭活容器应立即取样， 分别进行病毒灭活验证试验。2.3.8 超滤浓缩同一细胞批制备的多个单次病毒收获液经病毒灭活后， 进行适宜倍数的超滤浓缩至规定的蛋白质含量范围。2.3.9 纯化浓缩后的病毒液采用蔗糖密度梯度区带离心法或其他适宜的方法进行纯化。2.3.10

8、 脱糖将收集液以截留分子量 100kD 的膜进行超滤脱糖后，可加入适宜浓度的稳定剂，即为原液。2.3.11 原液检定按 3.2 项进行。2.4 半成品2.4.1 配制4用疫苗稀释液将原液按同一蛋白质含量和抗原含量进行稀释，总蛋白质含量不得超过 20ug/ml，加入适宜的稳定剂即为半成品。2.4.2 半成品检定按 3.3 项进行。2.5 成品2.5.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。2.5.2 分装及冻干应符合“生物制品分装冻干规程”规定。2.5.3 规格复溶后每瓶 0.5ml，每 1 次人用剂量 0.5ml。2.5.4 包装应符合“生物制品包装规程”规定。3 3检定检定3.1 单次病毒收

9、获液检定3.1.1 无菌检查依法检查（附录 XII A） ，应符合规定。3.1.2 支原体检查依法检查（附录 XII B） ，应符合规定。3.1.3 病毒滴定按 2.2.3.4 项进行，应不低于 7.0 Lg LD50/ml。3.2 原液检定3.2.1 无菌检查依法检查（附录 XII A） ，应符合规定。3.2.2 病毒灭活验证试验将病毒灭活后供试品脑内接种体重 1214g 小鼠 8 只，每只 0.03ml，同时腹腔接种 0.5 ml， 为第 1 代； 7 天后将第 1 代小鼠处死 3 只，取脑制成 10%脑悬液，同法脑内接种 1214g 小鼠 6 只，为第 2 代；7 天后将第 2 代小鼠处

10、死 3 只，同法脑内接种1214g 小鼠 6 只为第 3 代， 接种后逐日观察，3 日内死亡者不计， 观察 14 天，全部健存为合格。 （动物死亡数量应不超过试验用动物总数的 20% ） 。53.2.3 蛋白质含量应按附录 VI B 第二法进行测定，应按批准的标准执行。3.2.4 抗原含量采用酶联免疫法，应按批准的标准执行。3.3 半成品检定3.3.1 无菌检查依法检查（附录 XII A） ，应符合规定。3.3.2 抗原含量采用酶联免疫法，应按批准的标准执行。3.4 成品检定除水分测定外， 应按标示量加入灭菌注射用水， 复溶后进行以下各项检定。3.4.1 鉴别试验采用酶联免疫法检测， 应证明含

11、有乙型脑炎病毒抗原。3.4.2 外观应为白色疏松体，复溶后应为无色澄明液体，无异物。3.4.3 水分 应不高于 3.0%（附录 VII D） 。3.4.4 游离甲醛含量应不高于 10g/ml（附录 VI L） 。3.4.5 效价测定采用免疫小鼠中和抗体测定法， 以蚀斑减少中和试验测定中和抗体。 参考疫苗（RA 和 RB）以及中和试验阳性血清由国家药品检定机构提供。将被检疫苗(T)和参考疫苗(R)分别稀释成 1：32，腹腔免疫体重为 1214g 小鼠 10只，每只 0.5ml，免疫 2 次，间隔 7 天。第 2 次免疫后第 7 天采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于 56灭活 30 分钟。稀

12、释阳性血清、被检苗血清和参考苗血清，分别与稀释病毒(约 200PFU/0.4ml)等量混合，同时将稀释后的病毒再 1：2 稀释作为病毒对照，置 37水浴 90 分钟，接种 6 孔细胞培养板 BHK21 细胞，每孔 0.4 ml，置 37培养 90 分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于 37培育 5 天，染色，蚀斑计数，病毒对照组的蚀斑平均数应在 50150 之间。计算被检疫苗和参考疫苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。6蚀斑减少率=（1S/ CV）100%S 为被检苗平均斑数CV 为病毒对照组平均斑数按以下公式计算被检苗效力 T 值。T=（Y50）/ 47.762 Lg XT= 被检苗引起 50

13、%蚀斑减少的抗体稀释度的对数Y 为被检苗的蚀斑减少数X 为蚀斑中和试验时所用的血清稀释倍数结果判定：（1）合格： T （RA+RB）/ 2 0.33（2）重试：（RA+RB）/2 0.66 T（RA+RB）/ 2 0.33（3）不合格： T（RA+RB）/ 2 0.66 3.4.6 热稳定性试验疫苗出厂前应进行热稳定性试验， 于 37放置 7 天，按 3.4.5 项进行效价测定，仍应合格。如合格， 视为效价测定合格。3.4.7 牛血清白蛋白残留量应不高于 50ng/剂（附录 VIII F） 。3.4.8 无菌检查依法检查（附录 XII A） ，应符合规定。3.4.9 异常毒性检查依法检查（附录

14、 XII B） ，应符合规定。3.4.10 细菌内毒素含量测定应不高于 50EU/ml（附录 XII E 凝胶限量试验）3.4.11 抗生素残留量测定 细胞制备过程中加入抗生素的应进行该项检查， 采用 ELISA 法，应不高于 10ng/ml。3.4.12 Vero 细胞 DNA 残留量应不高于 100pg/剂（附录 IX B） 。3.4.13 Vero 细胞蛋白残留量测定采用酶联免疫法， 应不高于 2ug/ml， 并不得超过总蛋白含量的 10%。4 4保存、运输及有效期保存、运输及有效期于 28保存和运输。自生产之日起， 有效期为 24 个月。75 5 疫苗稀释剂疫苗稀释剂 疫苗稀释剂为灭菌注射用水，应符合对疫苗稀释剂有关要求。 5.1 疫苗稀释剂装量 5.2 疫苗稀释剂包装 5.3 疫苗稀释稀释剂有效期 5.4 疫苗稀释剂批准文号 5.5 疫苗稀释剂生产企业6 6 说明书说明书8