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1、单克隆抗体制备技术单克隆抗体制备技术 一、实验原理一、实验原理B 淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B 细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种 B 细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的 B 淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤
2、细胞变异株与脾脏的 B 细胞融合。采用 HAT 选择性培养基（hypoxanthine-aminopterin-thymidine 次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶） ，在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成 DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成 DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成 DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B 淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长
3、，一般于二周内均死亡。 单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：单一特异性，与一个抗原决定簇反应；可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；一经制出，可无限量地供应；生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。二、实验材料二、实验材料1。主要仪器CO2培养箱、台式离心机、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、酶标仪、电热恒温水浴箱、超纯水系统、超净工作台、核酸电泳仪、SDS-PAGE 电泳仪、Western Blotting 转膜仪、凝胶成像系统等。2主要试剂HAT 培养基（购自 Sigma 公司） 、HT 培养基（购自 Sigma 公司） 、RPMI1640培养基（购自
4、 GIBCO 公司） 、羊抗鼠 IgG-HRP 抗体（购自 Sigma 公司） 、羊抗鼠IgG-FITC 抗体（购自 Sigma 公司） 、胎牛血清（购自 GIBCO 公司） 、DMSO（购自Sigma 公司） 、50%PEG（购自 Sigma 公司） 、DMEM 培养基（购自 GIBCO 公司）等。3。实验动物6-8 周龄 Babl/c 小鼠，SPF 级，购自湖北省疾病预防和控制中心或武汉大学中南医院实验动物中心。三、操作程序三、操作程序以下为单克隆抗体制备的操作过程，值得注意的地方用小字体标出1、动物免疫动物免疫首先，取适量抗原(约 100ug)与等体积的佛氏完全佐剂乳化，免疫动物为 4-
5、6周龄的雌性 BALB/c 鼠。免疫方案及程序为:背部皮下注射佛氏完全佐剂乳化的抗原 100ug/只;2 周后换用不完全佐剂乳化等量抗原，背部皮下注射;间隔至少 1 个月后，三免,200ug/只;在融合前三天通过脾内、尾静脉注射进行加强免疫，抗原量为 200-300ug/只（一般为 100ug，如果抗原量过大的话，小鼠可能会发生应激死亡） ，不加佐剂。2 2、SP2/0SP2/0 骨髓瘤细胞的活化骨髓瘤细胞的活化 骨髓瘤细胞的复苏骨髓瘤细胞的复苏: : 从液氮罐中取出骨髓瘤细胞冻存管,放入 37水浴锅中至完全融化;1000r/min 离心 3-5min;倒弃上清液,用营养液(RPMI-1640
6、,小牛血清的浓度在 10%-20%)将下沉的细胞吹散悬浮后加入有适量营养液的细胞培养瓶中,置5%CO2 37培养箱培养;次日观察骨髓瘤细胞的生长情况,如为圆形,透亮,呈轻微贴壁生长,则说明骨髓瘤细胞生长良好,如发现有些细胞发暗,漂浮于液体中,则可以换液,弃去漂浮的死亡细胞,此时存活的细胞大部分可贴壁生长并增殖.培养 3-5d 后进行细胞传代,扩大培养.将细胞板中培养的 SP2/0 细胞，收集起来用 0.5ml1640 基础液悬浮.(0.51*106个)注射 BALB/c 小鼠背部皮下。待 910d 瘤子生长后，视大小选择取瘤细胞的时间。3 3、细胞融合、细胞融合一般在免疫小鼠加强免疫后 35
7、天做细胞融合结果比较好。在融合之前应将 PEG、40ml 终止液（基础 1640）和 HAT 培养基放入 37温箱预热备用。三种细胞的制备方法如下，结合以往做的经验，一般分离的顺序为：首先制备SP2/0 瘤细胞，然后制备饲养细胞，最后制备免疫脾细胞。3.13.1 SP2/0SP2/0 瘤细胞的制备瘤细胞的制备从小鼠背部生长的瘤子中制备的方法如下:1小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡 5min,超净台无菌状态取瘤；2先将肿瘤块剪下，放于匀浆器中，加 5ml1640 基础液充分研磨后，补加10ml1640 液，静置 2min，待较大的组织团块沉于管底后，吸取上层的细胞悬液于另一离心管备用，再补加 10m
8、l1640 液，重复两次（在重悬的过程中，第一次应只吸出 5ml，因为第一次匀浆器里面的细胞和大的组织块比较多，细胞下沉的速度比较） ；31000r/min 离心 10min 去上清，以基础 1640 液重悬细胞，将细胞悬液体积控制在 30ml；4于另一 50ml 离心管中加入 15ml 淋巴细胞分离液，将细胞悬液轻轻地加在分离液之上(比例为 1:2 到 1:1)；51200r/rnin 15min，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层， （吸管应该放在 50ml 离心管的中部去吸取，在离心管的内壁上有少许的组织和杂质，如果吸出的话，会影响瘤细胞的纯度）用 1640 液洗 2 遍，然后用 10m
9、l 1640 重悬细胞，计数后备用。3.23.2 免疫脾细胞的制备免疫脾细胞的制备1取加强免疫的 BALB/c 鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在 75%酒精中浸泡 5-10min 消毒;2将消毒好的老鼠固定于解剖板上，前肢固定，后肢固定，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织，剪破脾脏外膜（可以将脾脏少许剪几下，便于脾细胞的分离） ，放入灭菌的匀浆器中;3加 5ml1640 基础液于匀浆器中，研磨(不要太剧烈，以免损伤脾细胞，可选用比较松的匀浆器)，挤压出脾细胞，取出匀
10、浆棒，补加 10ml1640 基础液，静置 2min，吸取上层细胞悬液于另一无菌的 50ml 离心管，再补加 10ml1640 液于匀浆器中，同上重复 2 次（在重悬的过程中，第一次应只吸出 5ml，因为第一次匀浆器里面的细胞和大的组织块比较多，细胞下沉的速度比较）;41000r/min 离心 10min 去上清，细胞重悬后计数.3.33.3 饲养细胞的制备饲养细胞的制备1取一只未免疫的 BALB/c 鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。2四肢固定后，先撕开皮，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管 23ml（视老鼠大小而定）1640 基础液注入小鼠腹腔，吸打几次，再将液体吸出放于
11、一 50ml 离心管，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞。3同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。41000r/min 离心 10min 去上清，细胞用 HAT 培养基悬浮后，置于 37，5%C02培养箱中待用。3.43.4 细胞融合细胞融合1将 1-2x107个 SP2/0 与 108个免疫细胞(1:10-1:15)于 50ml 离心管中混匀，1000r/min，离心 8min。2倒空上清(用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动(便于PEG 充分的作用细胞)。3将装有细胞混合物的离心管放于 37水浴中。然后在 1min 内慢慢滴入预温至 37的 50%PEG 0.8ml(s
12、igma)，边加边轻轻用吸管尖搅拌。4继续搅拌 30s，静置 30s。5然后慢慢加入 37预温的 1640 基础液 10ml。具体方法为:第一分钟逐滴滴入 1ml。第二分钟加 lml， （前两毫升一定要在一分钟内缓慢的加入，并且要不断的搅动，切忌加入速度过快）第 34 分钟加 3ml，第 5 分钟加其余的 5ml，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入 30ml1640 液，也需慢慢加入。61000r/min 离心 5min，去上清于 37放置 5-8min。7用悬浮饲养脾细胞的 HAT 培养基与融合后的细胞混合（在用含有饲养细胞的HAT 培养基重悬融合离心以后的细胞时，可以多吹吸几次
13、，但是力度一定要小，因为刚刚融合到一起的细胞如果力度过大的话有可能会把它再次吹散） ，根据需要补加适量的 HAT 培养基，分种于 96 孔培养板中，约 250ul/孔。一次融合可接种 4-8 块 96 孔板。(根据需要也可少种，一般按 SP2/0 的细胞数计算，每孔接种量约含 104左右个 SP2/0 细胞)8于 37，5%CO2培养箱中培养。9融合后第二天开始观察，有无污染，第 4 天吸去 100ul 培养基换 HT 培养基100ul（或者吸去 80ul 培养基补加一滴。另外，不论是用移液器还是用吸管在补加 HT 培养基时，力度一定要小，一定要防止将细胞集落打散，打散的话，集落就很容易死亡）
14、 。待融合细胞集落长至培养孔 1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测（另外，在抗体检测之前这几天的观察过程中，如果发现集落的生长状态不好的话，一定要及时采取不久措施） 。4 4、间接、间接 ELISA 方法检测杂交瘤细胞上清方法检测杂交瘤细胞上清用间接 ELISA 筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下(整个过程中应该注意的是：每一次加样，不论是细胞上清、二抗以及洗涤液最好是悬空加，避免交叉污染)：1包被已知抗原:用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至 1-10ug/ml（一般为 15ug，具体的蛋白包被量应该按照方针滴定的结果来确定）;向微孔中每孔加 100ul,轻轻摇匀,4冰箱过夜或 37 1h;甩掉
15、孔内液体（尽量拍干空里面的液体） ，洗涤 3 次。每次 23 分钟。2封闭酶标孔中没被抗原包被的位置:向微孔中每孔加 200ul 封闭液（5%的脱脂奶粉或者 0.1%的 BSA）,轻轻摇匀, 37 1h;甩掉孔内液体;逐孔加满洗涤缓冲液（200ul,视现实情况而定。实验室现有黄色枪头只能吸这么多，再多的话会将洗涤液吸到移液器里，污染移液器）,静置 23min,甩掉孔内液体,拍干,用此法先用洗涤缓冲液洗 3 次。3加样:将待测的杂交瘤每孔取 50ul 上清液按顺序加入酶标孔中,轻轻摇匀.37 1h,洗涤,拍干。4加酶标抗抗体:先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度,每孔加入 100u
16、l,轻轻摇匀,置 37 1h;然后洗涤,拍干。5加显色液:每孔加新鲜配置的显色液 100ul,轻轻摇匀,37, 10min.6终止反应:每孔加终止液 50ul.7判定结果:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果,根据颜色深浅,判定.也可在酶标仪上测定 OD630nm值.5 5、杂交瘤细胞的克隆化、杂交瘤细胞的克隆化( (有限稀释法有限稀释法) )1克隆前制备小鼠饲养细胞层（根据经验，克隆的时候可以先制备好饲养细胞，值得注意的是制备好以后不要立即就将饲养细胞分装到 96 孔板里，如果先将饲养细胞铺到板子里的话，再加稀释好的杂交瘤细胞时，就将饲养细胞吹到了细胞板孔的周围，而中间的饲养细胞就很少，但是有时候杂交瘤细胞就是在细胞板孔的中间，这样的话，就不利于杂交瘤细胞的生长，因为，可以先制备好饲养细胞，放在一边，等克隆全部完成以后再将饲养细胞分铺到细胞板孔里，这样的效果会好很多） 。2将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞
