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1、 Beijing BLKW Biotechnology Co., Ltd. 人人 IL-10IL-10 定量分析酶联免疫检测试剂盒定量分析酶联免疫检测试剂盒 IL-10IL-10简介：简介：人 IL-10 是由 160 个氨基酸组成 4 个 螺旋结构的的细胞因子，分子量为 18.5 kDa。在水溶液中以二聚体形式存在，分子量约为 39 kDa。人 IL-10 是个多效性的因子，能够对多种细胞起作用，主要表现为免疫抑制和免疫刺激两方面的作用，特别是在调节淋巴系和髓系的细胞功能方面扮演重要的作用。IL-10 也具有单核细胞/巨噬细胞依赖、抗原刺激引起的的 PBMNC 和 NK 细胞合成其它细胞因子
2、的抑制作用。巨噬细胞膜介导的共刺激引起的 T 细胞和 NK 细胞活化后的产物及功能也可被 IL-10 所抑制。IL-10 是单核细胞/巨噬细胞功能的强有力的调节物。IL-10 作为细胞介导的免疫反应的抑制物，能够抑制像前列腺素 E2、TNF-、IL-1、IL-10 和 IL-8 等许多引起炎症的细胞因子。IL-10 能够促进可溶性 TNF 受体的释放和 ICAM1 和 B7 在细胞表面的表达。IL-10 还参与 B 细胞、柱状细胞及胸腺细胞的增殖和分化的调控。人的 IL-10 与鼠类的 IL-10 在 DNA 序列和氨基酸序列上高度同源，其 DNA 序列中一个开放的基因框与艾伯斯坦-巴尔病毒基
3、因组上基因框 BCRF1 高度同源，这可能在病毒感染中扮演重要角色的原因。在许多与寄生虫感染的报道中，IL10 表达也会增加，如曼森氏血吸虫感染、利什曼原虫感染、弓形虫感染、锥虫感染等。分枝杆菌的感染如麻风分枝杆菌、结核杆菌、 鸟分枝杆菌等的感染也会引起 IL10 的表达升高。 检测原理检测原理: :本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-10 的浓度。IL-10 捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IL-10 会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人IL-10 抗体后，抗人IL-10 抗体与IL-10 接合，形成夹心的免疫复合物
4、，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IL-10 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入中止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IL-10 浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-10 浓度。人定量分析酶联免疫检测试剂盒组成人定量分析酶联免疫检测试剂盒组成: :组分规格（96T/48T）人IL-10预包被板12条 /
5、 6条样本分析缓冲液5ml/3 ml标准品稀释液10ml/5ml人IL-10标准品4支/2支(冻干)人IL-10生物素化抗体10ml/5ml亲和素连接的HRP酶10ml/5ml浓缩洗涤液 2030ml/15mlTMB底物10ml/5 ml中止液5ml/3 ml封板胶纸3/2张说明书1份标本收集标本收集: :1.标本的收集请按下列流程进行操作：Beijing BLKW Biotechnology Co., Ltd. A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液； C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集； D. 若待测样本不能及时检测，标本收集后请
6、分装，冻存于20，避免反复冻融。2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除；4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。注：正常人血清或血浆样本请用标本缓冲液做倍比稀释后再检测。注：正常人血清或血浆样本请用标本缓冲液做倍比稀释后再检测。 注意事项注意事项: :1.试剂盒请保存在28。2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。3.标准品复溶加样后，剩余部分请丢弃。4.底物请勿接触氧化剂和金属。5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。7.充分混匀对保证反应结果
7、的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。8.室温反应，请严格控制在2528。9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。11.加样过程中避免气泡的产生。12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。检测前准备工作检测前准备工作: : 1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于28保存。2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。3.标准品:加入标准品稀释液 0.25ml 至冻干标准品瓶中使 IL-10 终浓度达到 2000pg/ml，室温反应，请严格控制在25
8、28。静置 15 分钟后轻轻混悬待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为 2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为 0 浓度.）洗涤方法洗涤方法: :自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。 实验过程需自备的材料：实验过程需自备的材料：1.不同规格的加样枪及相应的枪头； 2.酶标仪； 3自动洗板机； 4去离子水或双蒸水；操作步骤操作步骤: :Beijing BLKW Biotechnology Co., Ltd. 1.通过计算并确定一次性实验所需的
9、板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4。2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50ul样本分析缓冲液后加50ul标本，如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。 4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育60分钟。 6.洗板5次，且最后一
10、次置厚吸水纸上拍干。7.加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温孵育20分钟。8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温孵育20分钟。10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。 结果判断结果判断: :1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。4.若标本 OD 值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测
11、，计算浓度时应乘以稀释倍数。 典型数值和参考曲线典型数值和参考曲线浓度pg/ml典型OD值1典型OD值2OD平均值00.110.13320.121662.50.24680.36620.30651250.31040.41340.36192500.47480.6110.54295000.90451.06470.984610001.47871.52411.501420002.03342.24612.13975人人IL-10IL-10参考标准曲线参考标准曲线人 IL-10 标准曲线00.511.522.5062.512525050010002000 人 IL-10 浓度（pg/ml）OD值注意：本图仅
12、供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。Beijing BLKW Biotechnology Co., Ltd. 灵敏度，特异性和重复性灵敏度，特异性和重复性: :1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为8.8pg/ml。2.特异性：与人IL-10 sR,IL-10 R,IL-22,IL-24小鼠IL-10和猫IL-10等没有交叉反应。3.重复性：板内，板间变异系数均10%. 参考文献参考文献: :J Surg Res. 2001 Aug;99(2):187-93.Am J Gastroenterol. 2001 Jul;96(7):2098-102.J Immunol. 2001 Aug 1;167(3):1535-41.Immunol Invest. 2001 May;30(2):143-56.
