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1、1单克隆抗体的制备、纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的 B 淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫 B 细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在 HAT 培养基含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细
2、胞合成 DNA 的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成 DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在 HAT 培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2 培养箱、倒置显微镜等。四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。A可溶性抗原（蛋白质） 以 1m
3、g/ml5mgml 的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为 0.3ml0.6ml，间隔周再同样注射一次，天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原 0.2ml0.4ml，天后，杀死小鼠取脾做融合用。2B. 颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以浓度每只皮下注射.ml，每周次，共免疫次，取脾前天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫动物；目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。品系以 Balb/c 小白鼠应
4、用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从 Balb/c 小白鼠系诱导出来。Balb/c 系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以 812 周龄为宜。免疫程序、剂量和方法关系到能否得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的 B 淋巴细胞，一只纯种小白鼠能产生 1.01075.0107 种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的 B 淋巴细胞大量增加。B 淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的 B 淋巴细胞可能更易于融合
5、，而免疫以后 78 天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；脾细胞制备(1) 免疫过的血清抗体滴度高的 Balb/c 鼠，拉颈或用 CO2处死小白鼠。(2) 将小鼠放于 70酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。(3) 把脾放入 5ml 含有 2.5FCS 的 1640 液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。(5) 直立小试管 3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。(6) 以 2.5FC
6、S1640 充满离心管，并以 400g 离心 7min10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。(7) 把沉淀用约 10ml 的新鲜培养液再悬浮。3(8) 重复、步骤。(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于 80为合格。骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生 球蛋白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好
7、106 个细胞/ml；生长速度快，繁殖时间短。目前常用的 Balb/c 小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：S194/5XXOBU1；SP20Ag14（简称 SP2）；P2X？ Ag8653（简称 653）；FO以 653 最为常用，它是由矿物油 4甲基15 烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株 8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养
8、基内加入 15g/ml 8氮鸟嘌呤。取约 11076107对数生长期（即培养 15h20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以 2.5FCS1640 液再悬浮并计数。饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细
9、胞的好处是4：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如 C57 鼠，昆明小白鼠等。（1）拉颈处死小鼠。（2）70酒精浸泡消毒 10min。（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。（4）用注射器将 4ml 11.6蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉 1min 仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。（5）1 000rmin 离心 10min。（6）取上清，以 HAT 选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含 40 万个活细胞。（7）以 1ml 吸管将
10、细胞种入微量培养皿，每孔 0.05ml，含 2 万个细胞，放入 CO2 培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。4、细胞融合； 小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的 B 淋巴细胞在一般培养某中不易存活。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的 B 淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有 B 淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在 HAT 选择培养基中可以选择得到杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的
11、细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某 B 淋巴细胞产物单克隆抗体。（1）取末次免疫后的第 3 天小鼠脾细胞悬液，将 108 小鼠脾细胞与 1-5107SO2/O 小鼠骨髓瘤细胞混合于 50 毫升刻度离心管中，经 1000 转/分离心 7 分钟；5（2）弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置 37水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；（3）将 37水浴中保温的 50%PEG1.0 毫升（实际应用 0.7 毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在 60 秒钟内滴完，在 37水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；（4）加完 PEG 后
12、，将细胞悬液放在 37水浴中静置 90 秒钟，立即在 24 分钟内加入 15 毫升无血清的 RPMI-1640 培养基（37），开始要一滴一滴地加，由于稀释使 PEG 停止作用。注意尽可能不搅动细胞；（5）再经 100 转/分离心 10 分钟。弃去上清液，加 25 毫升 HAT 培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个 24 孔培养板中，每孔 0.5 毫升；（6）将培养板放在水蒸汽饱和 CO2 孵箱中，37孵育。CO2 含量为 5%；（7）每 2-3 天换一次 HAT 培养液，连续 2 周观察杂交瘤细胞是否出现。2 周后使用 HT 培养基。5、单克隆抗体检测 用检测抗体的方法从杂交细胞
13、中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多，从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的，而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的，所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。如：膜荧光检测法（1）材料：培养液 HEM 或 RPMI1640；荧光试剂：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠免疫球蛋白；50甘油缓冲液：1 份甘油加 1 份体积 0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成；荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。（2）操作方法：用培养液洗涤二次细胞，悬浮成 2.
14、0107ml；50l 细胞悬液加 50l 培养上清液混合，置 430min，用培养液洗涤 3 次，1 000r/min 离心；以 50lFITC抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞，水浴 30min60min；用冷培养液洗 3 次细胞，重新悬浮；取一滴细胞悬液滴在玻片上，复盖片，用甘油缓冲液封固，置荧光显微镜下观察。着色细胞也可以在固定后6观察，一滴细胞悬液，涂片、风干，用 95酒精固定 10min，固定后的载玻片用 PBS 洗涤，盖上盖玻片，进行观察。免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测 以琼脂双扩散试验法进行，此法简单易操作，特异性好。注意必须将培养液浓缩 1050 倍，否则做双向琼扩不出现沉淀线。其
15、检测方法为：（1）制备各种兔抗小鼠 IgG14、 IgM12、IgA12 和 K、 抗血清,也可直接购买。（2）取 5ml 培养物的上清液缓慢加入 0.5ml 的饱和硫酸铵溶液，混匀，静置 3h，离心沉淀，去上清，沉淀加 0.05ml 蒸馏水溶解。（3）制成 1琼脂糖凝胶板，打孔。中间孔加 20l 浓缩上清液，周围孔加 20l 特异性抗血清，以 10l 正常小鼠血清作对照。也可以采用酶联免疫吸附试验 ELISA、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测。6、克隆化经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞
16、同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要 35 次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。有限稀释法1材料（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔 2 万4 万。7（2）HT 培养基2操作方法（1）取出抗体阳性孔细胞，用 HT 培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。（2）用 HT 培养液将细胞稀释成 200 个/ml、40 个/
