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1、人巨细胞病毒U L l 3 6 编码蛋白相互作用蛋自的筛选和功能研究I d e n t i f i c a t i o na n dF u n c t i o n a lE v a l u a t i o no fI n t e r a c t i n gP r o t e i n so fH u m a nC y t o m e g a l o v i r u sU L136p r o t e i n研究生：崔鑫导师：盐蝗噬一级学科：! 直庭医堂论文课题起止时间：至Q ! Q 生至且二至Q ! ! 生2 月中国医科大学( 辽宁)20 12 年5 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明
2、所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：焦金日期：幽乏：苎：12中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中
3、国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：釜盆指导教师签名：玺擅重堕荭日期：趁墨! ：丛目录一、摘要中文论著摘要。1英文论著摘要5二、英文缩略语9三、论文前言1 0刖舌J u材料与方法：1 6实验结果3 3讨论3 9结论4 l四、本研究创新性的自我评价4 2五、参考文献4 3六、附录综述4 5在学期间科研成绩5 4致谢5 5个人简介5 6J j J 孙芋舻呦仑扰馋老友招。，吨努2 ，义一
4、缄I | ，q ，。一一( 、一一尸妒z 歹 物中文论著摘要人巨细胞病毒U L l 3 6 编码蛋白相互作用蛋白的筛选和功能研究目的人巨细胞病毒( H u m a nC y t o m e g a l o v i r u s ，H C M V ) 感染在人群中普遍存在，可引起新生儿多种畸形和疾病，也可引起免疫低下患者的致死性感染，其危害巨大。有学者推测H C M VU L b 区可能在病毒的复制、潜伏和对宿主的致病性方面起重要作用，因而U L b 区基因及编码蛋白在H C M V 感染和致病性方面受到特殊关注。位于U L b 区内的U L l 3 6 基因具有相应的m R N A 结构，其编码
5、蛋白分子量约为2 7 3 K D 的碱性蛋白，目前其编码蛋白的功能仍不清楚。本文从酵母双杂交筛4选、P u l l - d o w n 、激光共聚焦技术三个方面对H C M VU L l 3 6 编码蛋白相互作用蛋白进行了筛选和功能研究。实验材料与方法一、实验材料标本来自中国医科大学附属盛京医院病毒室保存的临床低传代H C M V 分离株H 株( 传代次数 1 535 、转接一定量的过夜培养物N 1 L 的Y P D A 液体培养基中，使O D 6 0 0 = 0 2 - - 0 3 ；6 、3 0 。C 摇床孵育3 d , 时左右( 2 3 0 2 7 0 r p m ) ，使O D 6 0
6、 0 达N o 537 、离心菌液，5 0 m l 离心管，1 0 0 0 95 分钟；8 、丢弃上清液，用总共5 0 0 m l 无菌水重悬细胞：9 、室温1 0 0 0 9 ，5 分钟离心，去上清；1 0 、用8 m l 新鲜配置的1 x T E L i A c 重悬细胞；试剂剂量1 0 x T E8 0 0 9 l10 x L i A e8 0 0 9 l去离子水6 4 m l1 1 、加入0 1 - o 5 m g 文库质粒和2 m l 鲑鱼精载体D N A ，混匀；1 2 、加入新鲜配置的5 8 m l P E G 几认c 溶液，混匀；1 3 、3 0 “ C 摇床中孵育3 0 分钟
7、( 2 0 0 r p m ) ；1 4 、加入7 m l 的D M S O 并轻柔颠倒混匀，不要震荡；1 5 、4 2 “ C 水浴锅中热休克1 5 分钟，每隔几分钟颠倒混匀；1 6 、将细胞至于冰上1 2 分钟；1 7 、室温1 0 0 0 9 ，5 分钟离心，去上清；1 8 、6 m l Y P D A 重悬细胞：1 9 、涂四缺( - L e u , 一T r p ，A d e ，H i s ) 平板( 4 0 0 u l 板) ，同时1 ：1 0 0 稀释涂布二缺( - L e u ，T r p ) 平板( 1 0 0 u l 板) ，计算转化效率； D 多竺：! ：!：，-H i
8、i l l l 卜a l r i n l p x y n a t ec u l t u r eo n S D ，- - d L H h “i 附- T r p X - a , - I e l一一I i n l - I l r i n g l n c r P l 瞻a u l h J r eo n S 1 1 - I n u - T n D 协l e g ta l lc o l | a m d c m m R n l s，n rI & 黜翁舻。rI I。曲。Is 啡触辫娑訾州_卜D ，b n r ，口_ 峨a n d I I l u e 妇i n d i 咖n h 憎_ 由n h 懈n t i
9、m - 驴押一嘲i m a l e i m图4 ，酵母双杂交筛选过程( 四) 显色反应1 、四缺平板培养的菌株在生长2 3 天后，挑出部分菌体涂布在润湿的滤纸上2 、在液氮中冻融2 次( 每次冻的时间为1 0 秒左右) ，室温中溶化后加入适量的显色液( 1 0 c m 直径的滤纸大约2 m 1 )显色液配方：试剂剂量Z b u f f e rX g a lB - M E4 m l1 3 3 6 r t l1 0 8 9 l3 、置于3 0 “ C 培养箱中避光6 小时，观察显色结果。( 五) 提取显蓝色的阳性克隆质粒并回转验证1 、玻璃珠法提酵母质粒( 1 ) 刮下部分显蓝色的菌落( 无菌操作
10、) 于1 5 m l E P 管中( 管中加入l m l水) ，1 6 0 0 0 9 5 分钟离心；。( 2 ) 去上清，加入2 0 0 9 ll y s i sb u f f e r 震荡重悬；( 3 ) 加入适量玻璃珠；( 4 ) 加入2 0 0 I - t l 酚氯仿；( 5 ) 震荡器上充分震荡1 0 分钟，1 4 0 0 r p m 以上，使细胞破壁；( 6 ) 加入2 0 0 9 l l T Eb u f f e r ，最大速度震荡几秒；( 7 ) 1 6 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，小心吸出上清，转移到另一个E P 管中；( 8 ) 加l m l 无水乙醇，颠
11、倒混匀后最大转数离心5 分钟；( 9 ) 倒掉上清，待乙醇挥发后，用1 5 I t l 水溶解质粒；2 、电转化( 1 ) 用无水乙醇清洗浸泡在无水乙醇中的电击杯，于超净台吹干，将上述提取的酵母质粒和0 I C M 的电击杯一起置于冰上预冷，准备l m lL B 液体培养基，于冰上预冷；( 2 ) 从一7 0 “ C 冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；( 3 ) 取5 u l 质粒加入到4 0 u l 感受态中，混匀后转入电击杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；( 4 ) 打开电转仪，将电击杯放入；( 5 ) 按一下p u l s e 键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入l m
12、 lL B 液体培养基，重悬细胞后，转移到1 5 m l 的离心管中；( 6 ) 3 7 ，2 2 0 - - 2 5 0 r p m 复苏1 小时；( 7 ) 离心5 0 0 0 r p m ，5 分钟，弃8 0 0 u l 上清，剩余液体将沉淀重悬，涂布于含有氨苄霉素抗性的平板中，放于3 7 过夜培养，次日查看转化结果。3 、P C R 反应，电泳观察结果挑取转化后生长出的克隆菌落( 取半个菌落，剩余半个菌落留取提质粒时使用) ，作为模板，进行P C R 反应，剩余培养基使用封口膜封口，置于4 冰箱P C R 反应体系：试剂体积( u 1 )模板p A C T 2 上游引物( 1 0 p
13、m o l )p A C T 2 下游引物( 1 0 p m o l )10 x T a qB u f f e rd N T Pm i x ( 1 0 m M )T a qD N Ap o l y m e r a s e ( 1U u L )H 2 0半个菌落0 4O 42 01 OO 1 61 6 0 4反应条件：3 0 c y c l e s 9 5 “ C5 m i n- 9 5 “ C4 5 s- 5 0 。C4 5 s ，7 20 Cl m i n 一7 2 “ C1 0 m i n4 、根据片段大小，选取剩余的半个菌落，进行摇菌扩增，提取质粒，并回转验证；( 1 ) 重悬：对摇菌扩
14、增后的菌落离心，在沉淀中加入2 5 0 u lC e l lR e s u s p e n t i o nS o l u t i o n 重悬；( 2 ) 裂解：加入2 5 0 u lC e l lL y s i sS o l u t i o n ，混匀；( 3 ) 变性蛋白质：加入1 0 u l A l k a l i n eP r o t e a s eS o l u t i o n ，混匀，室温静置5 m i n ；( 4 ) 中和：加3 5 0 u iN e u t r a l i z a t i o nS o l u t i o n ，混匀；( 5 ) 离心：1 4 0 0 0 9
15、，1 0 m i n ，留取上清；( 6 ) 再离心：将上清转移至分离柱中，再离心，1 4 0 0 0 9 ，l m i n ，弃滤液；( 7 ) 清洗：加7 5 0 u lC o l u m nW a s hS o l u t i o n ；( 8 ) 离心：室温离心l m i n ，弃滤液；( 9 ) 再清洗：加2 5 0 u lC o l u m nW a s hS o l u t i o n ，室温离心2 m i n ；( 1 0 ) 溶解：将分离柱转移至1 5 m l 的E P 管中，加入4 0 u lN u c l e a s e F r e eW a t e r ，静置1 m i n ，再离心1 4 0 0 0 9 ，l m i n ；2 6( 1 1 ) 测浓度：丢弃分离柱，测E P 管中的质粒浓度，置于4 。C 冰箱。再
