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1、吸附于沙尘暴颗粒物上的微生物对卵蛋白诱导的小鼠气道炎症的实验研究M i c r o o r g a n i s m sA t t a c h e do n t oA s i a nS a n d D u s tE n h a n c e dO v a l b u m i n i n d u c e dR e s p i r a t o r yI n f l a m m a t i o ni nA s t h m a t i cM u r i n e导师：型：责整论文课题起止时间：至Q ! Q 生! Q 旦= 至Q12 生三月论文完成时间：至Q ! 至生垒旦中国医科大学( 辽宁)20 12 年5
2、 月f f l f l rIJ Ir f rl lr lrH II l l l l l lr lPIff Y 2 0 9 14 0 7中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：亟l 焦鱼日期：劢I 子I 岁中国医科大学研究生学位论文
3、版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：皇! 遵鱼 指导教师签名：亟兰盔&日期：竺岁t p目录一、摘要中文论著摘要1英文论著摘要7二、英文缩略语1 4三、论文癌行一言1 5丑U 舌材料与方法1 6实验结果
4、2 1讨论4 7结j 沦5 0四、本研究创新性的自我评价5 1五、参考文献5 2六、附录综述5 7在学期间科研成绩6 8致谢6 9个人简介7 0中文论著摘要吸附于沙尘暴颗粒物上的微生物对卵蛋白诱导的小鼠气道炎症的实验研究刖舌沙尘暴( s a n dd u s t ，S D ) 是中国北方较为常见的一种灾害性天气现象，近年来沙尘暴的发生频率越来越高并且波及范围越来越广。常发生在春季的亚洲沙尘暴f A S D ) 起源于戈壁沙漠、塔克拉玛干沙漠等中国内陆黄土地区，颗粒物向下风向地区扩散，不仅波及中国东部、朝鲜半岛和同本，更远的可以飘过太平洋最终到达美国，遍及大半个北半球。A S D 由于吸附性强，
5、可携带多种化学物质，如来源于大气污染物( s 0 2 ，N 0 2 ) 的硫酸盐( s 0 4 2 ) 和硝酸盐( N 0 3 - ) ，还包括一些微生物，如细菌、真菌、真菌孢子和病毒。近年来，随着这种生物气溶胶( 生物颗粒) 对所波及地区的生态系统和人类健康造成严重影响，吸附于A S D 上的微生物群落引起了广泛关注。亚洲沙尘暴浮尘颗粒物及这些微生物与呼吸系统的健康状况及迅速增长的发病率、死亡率有关。大量的流行病学调查显示，在沙尘暴发生期间，中国的肺炎入院率和韩国首尔的每日死亡率都有增加。有报道称，在台湾，沙尘暴发生与死亡率、心血管疾病的急诊处理以及肺炎入院率的增多保持一致。类似的现象在日本
6、也有报道，日本雪杉树引起的花粉病、季节性变应性鼻炎的恶化以及成人和儿童哮喘的加剧都在沙尘暴发生期间出现。因此，流行病调查结果表明在沙尘暴发生期间，由微生物和A S D 联合作用可引起肺炎或过敏性疾病的恶化，需要实验性的研究来证实流行病调查的结果。我们以前的研究显示，在O V A 刺激的小鼠气道上皮组织中发现，通过观察支气管肺泡灌洗液( b r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i d ，B A L F ) 和组织学检查细胞图像，野生型A S D 可增强过敏性气道炎症及杯状细胞的增殖，同时发现伴有嗜酸性粒细胞的抗原相关气道炎症加剧了，B A L
7、F 中促炎症细胞因子如I L 5 、M C P 一3 、I L 1 3 、嗜酸细胞活化趋化因子和抗原特异抗体的产物( I g E ，I g G l ) 的表达增强。然而，经过3 6 0 0 C 加热除去毒性物质( 如微生物、S 0 4 厶、N 0 3 “ 等) 的A S D ( h e a t e dA S D ，H A S D ) 却只造成了轻微的影响，因此沙尘暴颗粒物表面附着物对炎症加剧起到了重要作用。本研究中使用电子加热器将采集于日本福冈县北九州市的沙尘暴颗粒的样本进行加热处理，以除去吸附于其表面的微生物、S 0 4 2 和N 0 3 等成分。本实验采用的微生物来自于石川县珠洲市上空的颗
8、粒表面，共7 种微生物，有：N o c a r d i o p s i ss p ( N o 1 4 ) ，B a c i l l u ss p ，S t r e p t m y c e ss p 和B j e r k a n d e r as p 。本研究应用O V A 致敏小鼠，采用气管灌注的方法，分别将加热处理的A S D ( H A S D ) 、和加入各种微生物的H A S D 悬浮液注入小鼠气管内，观察小鼠肺组织病理形态学变化，支气管肺泡灌洗液( B A L F ) 中炎症细胞的分布变化，B A L F 中细胞因子和趋化性细胞因子的蛋白表达改变。从中筛选出一种恶化作用最为强烈的微生
9、物，进行进一步验证实验。本研究是关于沙尘暴颗粒物附着的微生物对O V A 诱导哮喘小鼠气道炎症作用的研究。实验方法l 、样本的采集本研究使用的黄沙在2 0 1 1 年5 月1 日至3F 1 在日本福冈北九州市折尾地区的产业医科大学上空采集，由L I D A R ( L i g h tD e t e c t i o nA n dR a n g i n g ) 检测这批颗粒物的密度变化为3 5 0l x g - 5 5 0I t g m 3 ( 结果来自于日本长崎县公共健康与环境科学省) 。应用图像分析软件( O L S 3 5 0 0 S F T - 3 5 0 0 ，O l y m p u s
10、a n dS h i m a d z u ) 分析显微图像得到颗粒的粒径大小，该方法最低检出限为1g m ，粒径分布主要在2 8 5 9l x m o2 、样本的处理分别将采集到的A S D 样本在电子加热器中经过3 6 0 0 C 加热处理3 0r a i n ，以除去吸附于颗粒物表面的微生物、S 0 4 2 和N 0 3 等成分。3 、微生物的分离及获取本研究使用的7 种微生物是在2 0 0 8 年5 月7 日日本石川县珠洲市采集的黄沙颗粒上分离培养的。将采集到的黄沙分别用营养琼脂、血琼脂、马铃薯葡萄糖琼2脂以及沙保罗培养基培养，得到7 种微生物。经过D N A 分析，确定它们分别是N o
11、 c a r d i o p s i ss p ( N o 1 _ 4 ) ，B a c i l l u ss p ，S t r e p t o m y c e ss p 和B j e r c a n d e r as p 。这些微生物用1 福尔马林l 小时失活，而后以1 5 0 0 r p m 离心1 0m i n ，去掉上清液，余下减压干燥备用。4 、实验动物及染毒从C h a r l e sR i v e r 公司( 神奈川，日本) 购入5 周龄雄性I C R 小鼠，适应性喂养一周后，筛选出体重异常和或病态的小鼠，开始实验。根据微生物种类的不同将实验动物分成9 个组，每组1 5 只不等，
12、各实验组分别为：卵白蛋白( O v a l b u m i n ，O V A ) 组，O v A + H A S D 组，O V A + H A S D + N o c a r d i o p s i ss p ( N o 1 4 ) ，O V A + H A S D + B a c i l l u ss p ，O V A + H A S D + S t r e p t o m y c e ss p 和O V A + H A S D +B j e r c a n d e r as p ，共2 9 只。每周将小鼠在4 - - 一- - 氟溴氯乙烷作用下麻醉，经气管注入H A S D ( 0 1m
13、 l m o u s e ) 和O V A ( O 1m l m o u s e ) 以及7 种失活微生物3 5 肛g ，共投与四次。在取得实验结果之后，选出作用最强的一种微生物，继续动物实验。每间隔一周，将小鼠4 三氟溴氯乙烷作用下麻醉，经气管注入颗粒物( O 1m l m o u s e )和或O V A ( 0 1m l m o u s e ) 和或微生物( 2 I t g , m o u s e 或8 I t g m o u s e ) 。最后一次染毒的第二天，经小鼠腹腔注射2 0 戊巴比妥，将其深度麻醉，用放血法处死。5 、实验动物的病理检测取小鼠肺部固定于1 0 中性福尔马林缓冲液
14、中，肺叶分离后，将其切割成2m m厚的碎块，用石蜡包埋，制成3 扯m 厚的切片。H E 染色后观察呼吸道由近端向远端嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润情况。P A S 染色后观察支气管上皮杯状细胞的增殖情况。应用显微镜对每个切片的呼吸道中炎症细胞和上皮细胞进行观察。6 、采集支气管肺泡灌洗液和血液小鼠深度麻醉后心脏采血，1 5 0 0r p m 离心1 0m i n ，取上清液，8 0 0 C 的深度冰箱中保存用于检测血清O V A 特异性抗体I g G l 和l e e 的表达。取小鼠心脏血后，气管固定，用无菌生理盐水灌洗小鼠肺部两次，收集灌洗液后离心。取上清液，8 0 0 C 的深度冰箱中保存，用
15、于检测肺泡灌洗液中细胞因子和趋化因子的蛋白表3达。7 、支气管肺泡灌洗液中的细胞计数将肺泡灌洗液离心后得到的沉淀悬浮于生理盐水中，制成细胞悬液，显微镜下应用血细胞计数器直接计数细胞总数。细胞悬液应用细胞离心涂片机，离心后制成细胞涂片。应用D i f f - Q u i k 染色后，显微镜下观察计数中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞。8 、支气管肺泡灌沈液中的细胞因子和趋化因子的检测应用酶联免疫反应检测B A L F 中细胞因子和趋化因子的蛋白表达。其中细胞因子包括：白细胞介素( I n t e r l e u k i n ，I L ) 1 1 3 、I L 4 、I L 一5 、I L - 6 、I L - 1 2 、I L - 1 3
