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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺搿参r 号蹴蜷轹啦刷醛氧紫学竺三楚岁河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：多于衣导师签章：；匿一I 年多月矿日目录I | l J 舢| J I 川 Y 2 10 4 8 0 4中文摘要”1英文摘要4研究论文人脐带间充质干细胞移植对实验性大鼠脑出血作用研究前言8月U 舌芍材料与方法8纬栗附图21附表2 9讨论3 0结论3 5参考文献”3 5综述干细胞移植治疗
2、大鼠脑出血的实验研究3 9致谢”5 0个人简历：”51中文摘要人脐带间充质干细胞移植对实验性大鼠脑出血作用研究摘要目的：将人脐带间充质干细胞( h u m a nu m b i l i c a lc o r dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，h U M S C s ) 移植到大鼠脑出血模型，观察移植细胞在大鼠出血损伤脑组织中的存活、迁徙和神经分化情况，探讨h U M S C s 移植对大鼠脑出血后神经功能恢复的影响及其作用机制，为h 切S C s 在神经科学领域的临床应用提供理论依据及实验基础。方法：无菌条件下收集足月妊娠剖宫产新生儿脐带，D H
3、a n k s 洗去血管内的残存血，剔除脐带动静脉，将剩余的组织剪碎至1m m 3 大小的组织块，O 2 胶原酶I I 消化，在含有2 0 胎牛血清( 先t a lb o v i n es e r u m ，F B S ) 、2n m l 表皮细胞生长因子( e p i d e m a lg r o 、砒f a c t o r ，E G F ) 、2 5I n M 左旋谷氨酰胺( L g l u t 锄i n e ，L G l u ) 、1 0 0U m 1 青霉素，1 0 0p g m l 链霉素的 D 砸M F 1 2 培养基进行原代培养。观察原代培养细胞的形态学变化，当细胞达到融合状态时
4、，加入0 2 5 胰酶1m ME D T A 消化细胞，并传代。收集消化后的细胞，以流式细胞法行细胞表型检测，包括P E C D l l b ，P E C D 4 5 ，P E C D 7 3 ，P E C D 9 0 ，P E C D10 5 ，P E H L A D R ( H L A I I ) ，F I T C C D l 9 ，和F I T C C D 3 4 并以F I T C 或P E 标记的小鼠I g G l 作为同型对照。选取体重在2 7 0 3 0 0g 之间的成年雄性S p r a g u e - D a w l e y ( S D ) 大鼠，根据包新民大鼠脑立体定位图谱
5、定位，用直径lm m 的牙科钻头在大鼠右侧颅骨( A P = 0 5m m ；池= 3 OH u n ) 钻孔，将微量注射器固定在立体定向架上，取胶原酶V I I 水溶液2u 1 ，以前囟为参照点缓慢注射到右侧尾状核头部( A P = O 5m m ；M L = 3 Om m ；D V = 5 5m m ) ，建立大鼠脑出血模型( i n t r a c e r e b r a lh e m o m a g e ，I C H ) 。脑出血模型建立成功后2 4h ，采用改良神经功能缺失评分( m o d i f i e dn e u r o l o g i c a ls e v e r i t
6、ys c o r e ，m N S S ) 对实验动物进行神经行为学评价，选取评分在7 1 2 分间( 中度损伤) 大鼠纳入实验，随机分为三组：( 1 ) h 切S C s 移植组，n = 2 0 ；( 2 ) 磷酸盐缓冲液( P h o s p h a t e B u 虢r e dS a l i n e ，P B S ) 对照组，n = 2 0 ；( 3 ) 假手术组( s h a m 组) ，n = 5 。将大鼠再次麻醉，头部固定于立体定向架上。用1 0 “L 的H a m i l t o n中文摘要注射器，将1 ，1 双十八烷3 ，3 ，3 ，3 四甲基吲哚羰花青高氯酸盐( 1 ，1 d
7、 i o c t a d e c y l 3 ，3 ，3 ，3 t e t r a m e t h y l i n d o c a r b o c y a n i n ep e r c h l o r a t e ，D i I ) 标记的h L 丌S C s 缓慢注射到h 切S C s 组大鼠的右侧出血灶区域边缘( A P = O 5m mM L = 3 Om mD V = 3 5m m ) 。每只大鼠接受1 0 此注射，共2 1 0 5 细胞。拔针后用医用生物蛋白胶将注射针孔及骨孔封闭。P B S 对照组依同样方法注入等量的P B S 替代h 切S C s 。细胞移植后1 、7 、1 4 、
8、2 1 、2 8 、3 5d 对所有大鼠进行m N S S 评分；将大鼠处死迅速断头取出全脑连续冰冻切片，免疫荧光染色检测D i I 标记h U M S C s 在出血脑组织中存活、迁徙以及成熟神经元标志微管相关蛋白2( m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e dp r o t e i n2 ，M A P2 ) 、神经胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白( g l i a l 佻r i l l a 巧a c i d i cp r o t e i n ，G F m ) 的表达情况。采用S P S S1 5 Of o rW i n d o w s 统计学软件对实
9、验数据进行统计分析。结果：细胞培养第2d 即可见有少量形态各异的贴壁细胞，散在分布。1 W 左右时，贴壁细胞形成集落，以后见成纤维细胞样克隆形成，克隆呈放射状生长。在培养2W ，细胞接近9 0 汇合时，经消化后按1 ：2 的比例将细胞传代。传代后数小时内可见其迅速贴壁，1W 左右达到9 0 9 5 汇合程度，低倍镜下细胞呈排列紧密的漩涡样结构。流式细胞检测显示这些细胞均一地高表达M S C s 标志C D 7 3 、C D 9 0 、C D l 0 5 。不表达造血系标志C D 3 4 、C D 4 5 ，中性粒细胞标志C D l l b ，人B 细胞标志C D l 9 。对组织相容性免疫表型
10、的分析显示h U M S C s 不表达人白细胞抗原H L A D R ( H L A I I ) 。细胞移植后2 4h ，S C s 移植组、P B S 对照组大鼠的m N S S 评分之间没有显著性差异( P O 0 5 ) ，但与假手术组比较，均存在显著性差异( P O 0 5 ) b e t w e e nt h em N S Ss c o r e so ft h eh U M S C st r a n s p l a n t a t i o n 铲仪l pa n dt h eP B Sc o n t r o lg r o u p H o w e V e r ，i nc o m p a
11、 r i s o nw “- hs h 锄g r o u p ，t 1 1 e r ei ss i g I l i f i c a n td i 腩r e n c e ( P 5 0 0 ，则需重新调整细胞浓度。研究论文4 ) 合计1 0 个大方格的细胞数( 每室5 个，共2 室) ，按下列公式计算每m L 细胞数以及原细胞总数：细胞数m L = 每个大方格的平均细胞数x1 0 4x 稀释倍数细胞总数= 细胞数m L 测定液的总体积5 、) 测数完毕，取下盖玻片，用双蒸水将血球计数板冲洗干净，洗净后自用吹风机吹干，勿使细胞悬液在计数器上干燥。2 3 2 细胞活力检测在细胞培养中为了调整接种密度
12、及确定细胞存活比，在细胞接种前采用台盼蓝( T 呵p a nB 1 u e ，T B ) 拒染法测定存活细胞数量。正常的健康细胞能排斥染料，不能被染色。但细胞膜完整性破坏后台盼蓝可渗入胞浆，胞体被染成淡蓝色。为此采用染料排斥实验大体估计细胞存活率。操作步骤：1 ) 无菌状态下取待测样本( 单个细胞悬液) O 5I n L ，用O 0 1MP B S 液稀释至约2 1 0 5 5 1 0 5 细胞n l L ；2 、) 取9 滴上述细胞悬液移入小试管中，加1 滴O 4 台盼蓝溶液，混匀；3 ) 在3m i n 内用血球计数板计数5 0 0 个细胞。分别计数活细胞( 未着色细胞) 和死细胞( 着色
13、细胞，染成淡蓝色)4 ) 根据被染成淡蓝色的细胞数，按公式计算细胞的存活率：活细胞率( ) = 活细胞总数( 活细胞总数+ 死细胞总数) 1 0 0 2 4P 5 代h U M S C s 表面分子标志检测分别用藻红蛋白( p h y c o e r y t M n ，P E ) 标记的鼠抗人单克隆抗体C D l1 b ，C D 7 3 ( S H 3 ) C D 9 0 ，C D 4 5 ，C D l 0 5 ，H L A D R ( H L A I I ) 和异硫氰酸荧光素( F l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，F I T C
14、 ) 标记的鼠抗人C D 3 4 ，C D l 9标记h U M S C s 。分别以相应抗鼠I g G l 一P E 和I g G l 一F I T C 作为同型对照。具体操作如下：1 ) 将P 5 代细胞培养瓶内培养液吸弃后，O 0 1MP B S 洗涤后，加入3 - 4m lO 2 5 胰酶1m ME D T A 消化( 要求每份待测样本细胞数芝1 0 5 ) ，4 5 0 0r p m 离心3m i n ，弃上清( 此时E P 管中残余P B S 液约4 0 5 0 止) ；2 ) 分别加入鼠P E 或F I T C 标记的抗人单克隆抗体C D l l b 、C D 7 3 、C D 9 0 、C D 4 5 、C D 3 4 、C D l 9 、H L A D R 以及抗鼠I g G l P E 和I g G l F I T C研究论文同型对照7u L 、充分混匀、4 下避光孵育3 0m i n ；3 ) 加入1m LO 0 1MP B S 洗涤，4 5 0 0 印m 离心3m i n ，弃上清；4 ) O 0 1MP B S 重复洗涤2 次后加入O 0 1MP B S4 0 0 此重悬细胞，冰上孵育待检测。2 5 大鼠脑出血I C H 模型制作参照包新民大鼠脑立体定位图谱，运用立体定向仪向尾状核注射胶原酶来制作S D 大鼠脑
