《细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)活性免疫捕获定量检测试剂盒》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)活性免疫捕获定量检测试剂盒（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1细胞基质金属蛋白酶细胞基质金属蛋白酶 2（MMP-2）活性免疫捕获定量检测试剂盒产品说明书）活性免疫捕获定量检测试剂盒产品说明书 （中文版）（中文版）主要用途主要用途细胞基质金属蛋白酶 2（MMP-2）活性免疫捕获定量检测试剂是一种旨在通过使用 MMP-2 特异性抗体捕获样品中的 MMP-2 抗原蛋白，识别并切离人工合成含硫多肽，释放出巯基，进而使用 Ellman 试剂，产生黄色 5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）样品中基质金属蛋白酶 2 的特异活性定量检测。产
2、品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。技术背景技术背景基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst） 、血管形成、组织再吸收（tissue resorption） 、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原
3、酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化、型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化、型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理
4、激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-2，又称明胶酶A （gelatinase-A）或IV型胶原酶（type IV collagenase），其前体分子量为XX，激活后分子量为XX和XX。它在血清或细胞上清中浓度通常为10至200纳克/毫升。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤维连接蛋白（fibronectin）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白-5 （laminin-5）、前体肿瘤坏死因子-（pro-TNF-）和神经（蛋白）聚糖（neurocan）。基质金属蛋白酶-2与肿瘤发展与转移、血管形成、动脉粥样硬化等疾病有关。基质
5、金属蛋白酶2的活性检测通过使用MMP-2特异性抗体涂板在孔板里的相应孔里，然后捕获样品中的MMP-2抗原蛋白，在胶原酶潜酶活化剂醋酸氨基苯汞（4-aminophenylmercuric acetate；APMA）的存在下，识别并切离人工合成含硫多肽（thiopeptide）底物Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）-LG-OC2H5，释放出巯基（sulfhydryl group） ，进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）5,5-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid） ；DTNB反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯
6、甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB） ，通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量测定组织基质金属蛋白酶2的特异活性。其反应系统为：产品内容产品内容清理液（Reagent A） XX 毫升2裂解液（Reagent B） XX 毫升抗体液（Reagent C） XX 毫升缓冲液（Reagent D） XX 毫升封阻液（Reagent E）XX 毫升激活液（Reagent F）XX 毫升反应液（Reagent G） XX 毫升标准液（Reagent H） XX 微升稀释液（Reagent I）XX 毫升产品说明书 1 份保存方式保存方式保存 标准液（Reagen
7、t H）在-70 冰箱里；保存 抗体液（Reagent C） 激活液（Reagent F）和 反应液（Reagent G）在-20冰箱里，其余的保存在 4冰箱里；有效保证 3 月用户自备用户自备1.5 毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞（微型）台式离心机：用于样品操作培养箱：用于反应孵育酶标板：用于反应分析的容器酶标仪：用于比色分析实验步骤实验步骤实验开始前，将20冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备一、样品准备1准备好 25cm2细胞培养瓶或 60mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X
8、 106细胞）2小心加入 XX 毫升 清理液（清理液（Reagent A） ，覆盖生长表面3小心抽去清理液4使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）5加入 XX 毫升 清理液（清理液（Reagent A） ，混匀细胞6移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）7放进 4台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g8小心抽去上清液9加入 XX 微升 裂解液（裂解液（Reagent B） ，充分混匀10 转移到预冷的 1.5 毫升离心管11强力涡旋震荡 15 秒12 置于冰槽里孵育 30 分钟13 放进 4微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 1
9、3000RPM，例如 eppendorf 5415）314 小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管15 移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 MB30030.1）16 使用 稀释液（稀释液（Reagent I）调节蛋白浓度为 XX 毫克/毫升17 即刻放进70保存或置于冰槽里继续后续操作二、二、 测定准备测定准备1 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液等） ，置于冰槽里2 设定好酶标仪（温度为 37）：波长 412nm三、三、 标准样品配制标准样品配制1 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管2 分别加
10、入 XX 微升 稀释液（稀释液（Reagent I）到 1 至 5 号管3 移取 XX 微升 标准液（标准液（Reagent H）到 1 号管，混匀4 小心移取 XX 微升 1 号管稀释的 标准液（标准液（Reagent H）到 2 号管，混匀5 小心移取 XX 微升 2 号管稀释的 标准液（标准液（Reagent H）到 3 号管，混匀6 小心移取 XX 微升 3 号管稀释的 标准液（标准液（Reagent H）到 4 号管，混匀7 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表管号 稀释液（稀释液（Reagent I） 标准液（标准液（Reagent H）标准标准 MMP-2 浓度浓
11、度1XX 微升XX 微升XX 纳克/毫升2XX 微升XX 微升 1 号管XX 纳克/毫升3XX 微升XX 微升 2 号管XX 纳克/毫升4XX 微升XX 微升 3 号管XX 纳克/毫升5XX 微升00四、样品测定四、样品测定1 在酶标板上做好相应标记：标准样品、样品活性2 分别移取 XX 微升 抗体液（抗体液（Reagent C）到酶标板的相应孔里3 放进 4冰箱里孵育 16 小时（或室温下孵育 2 小时）4 小心抽去 抗体液（抗体液（Reagent C） ，确保无液体残留5 分别加入 XX 微升 缓冲液（缓冲液（Reagent D）6 小心抽去 缓冲液（缓冲液（Reagent D） ，确保无
12、液体残留7 重复实验步骤 5 至 6 一次8 分别加入 XX 微升 封阻液（封阻液（Reagent E）9 室温下孵育 60 分钟10小心抽去 封阻液（封阻液（Reagent E） ，确保无液体残留11分别加入 XX 微升 缓冲液（缓冲液（Reagent D）12小心抽去 缓冲液（缓冲液（Reagent D） ，确保无液体残留13重复实验步 11 至 12 一次14分别加入 XX 微升上述配制的 标准液标准液和待测样品（100 微克蛋白总量）到相应孔里15放进 37培养箱里孵育 60 分钟416小心抽去 标准液标准液和待测样品，确保无液体残留17分别加入 XX 微升 缓冲液（缓冲液（Reage
13、nt D）18小心抽去 缓冲液（缓冲液（Reagent D） ，确保无液体残留19重复实验步 17 至 18 三次20分别加入 XX 微升 激活液（激活液（Reagent F）21放进 37培养箱里孵育 120 分钟22小心抽去 激活液（激活液（Reagent F） ，确保无液体残留23分别加入 XX 微升 反应液（反应液（Reagent G）24放进 37培养箱里孵育 60 分钟（注意：如果活性过低，可以延长孵育时间至 6 小时）25即刻放进酶标仪（412nm 波长）检测，获得吸光读数 26构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为吸光读数 OD；横座标（X 轴）为标准 MMP2 浓度（纳克/毫升）2
14、7根据标准曲线获得样品对应 MMP2 浓度（纳克/毫升）五、计算样品活性单位五、计算样品活性单位XX注意事项注意事项1 本产品为 25 次操作，包括标准液2 本产品的检测敏感度为 1 纳克/毫升3 操作时，须戴手套4 系统操作过程中，标准液测定只需 1 次5 样品准备要点如下：a)样品中避免使用 EDTA、EGTA 等二价阳离子鳌和剂b)样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）c)如果样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂（建议使用 胶原酶潜酶活化剂（APMA） MB12197）6 待测样本为总蛋白，其蛋白浓度为 100 微克/100 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 MB30030.1） 7 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度8 标准液（标准液（Reagent H）的活性单位为 1.4 毫单位/纳克蛋白9 用户可以根据标准液的活性单位将样品的浓度换算成活性单位10基质金属蛋白酶 2 活性单位浓度定义：在 37温度下，pH 7.5 的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解 1 纳摩尔的多肽底物 PLGLAR11本公司提供系列基质金属蛋白酶检测试剂产品质量标准质量标准1 本产品经鉴定性能稳定2 本产品经鉴定检测敏感
