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1、20 12 年3 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明一嬲本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：釜嘘日期：鲨! 乙j 二中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医
2、科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：么塾! 曼 指导教师签名_ 皇型虹日目录一、摘要中文论著摘要。l英文论著摘要3二、英文缩略语5三、论文前言。6材料与方法6结果8讨论1 1结论1 2四、本研究创新性的自我评价1 3五、参考文献1 4六、附录综述l6致谢2 3个人简介2 4中文论著摘要G I R K l 在肺癌中的
3、表达及临床意义目的钾离子通道广泛分布于各种组织的细胞膜上，在维持细胞膜电压、细胞内的p H 值及细胞容积的调节等方面发挥着重要的作用。另外，钾离子通道与细胞的增殖及凋亡有关，在多种肿瘤细胞中大量过表达。G I R K 属于内向整流型钾离子通道，存在5 种不同类型的亚单位，其中G I R K I - 4 表达于哺乳动物组织细胞膜上。本研究通过免疫组化技术检测肺癌组织中G I R K I 的表达水平，探求G I R K l 与肺癌患者临床病理数据的关系。材料和方法一、材料来源收集中国医科大学附属盛京医院胸外科2 0 0 5 年1 月至2 0 0 5 年1 2 月期间手术切除肺癌标本6 0 例，其中
4、男性4 5 例，女性1 5 例。全部病例术前均未接受化、放疗，肿瘤组织经病理学检查证实分别为肺鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌及小细胞癌。二、实验方法本实验采用免疫组织化学的方法，检测G I R K l 在6 0 例肺癌组织中的表达情况。使用S P S S l 3 0 统计软件进行统计学分析，采用，检验进行组间差异性比较，P 0 0 5 ) C o n c l u s i o n s1 G I R K lp r o t e i ne x p r e s s i o nW a ss i g n i f i c a n t l ya s s o c i a t e dw i t hl y m p hn
5、o d em e t a s t a s i s I tc o u l dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed e v e l o p m e n to fl u n gc a r c i n o m a 2 G I R K lp r o t e me x p r e s s i o nW a ss i g n i f i c a n t l ya s s o c i a t e dw i t hs t a g e ，I tc o u l ds e r v ea sau s e f u lp r o g n o s t i cm a r k e
6、 ri nt h el u n gc a r c i n o m a 3 G I R K lc o u l db eac a n d i d a t ef o rap h a r m a c e u t i c a lt a r g e t , d e p e n d i n gu p o nf u r t h e rf u n c t i o n a ls t u d i e s K e yw o r d sG I R K l ；L u n gc a r c i n o m a ；I m m u n o h i s t o c h e m i c a l45论文G I R K l 在肺癌中的
7、表达及临床意义刖菁肺癌居癌症死因首位，而且男性肺癌的患病率和女性肺癌死亡率仍有上升趋势。在过去的3 0 年中，肺癌的生存率没有很大的提高，一直在1 3 左右。早期诊断和改进治疗成为提高生存率的有效手段【l 】。分子生物学的发展使之成为可能。国内外研究报道：钾离子通道与肿瘤细胞增殖和凋亡关系密切1 2 1 ，且在肺癌组织中大量表达，并与肺癌的发生发展密切相关【3 一。因此，对钾通道的研究已成为热点。钾离子通道通过蛋白复合体的形式镶嵌在细胞膜脂质中，广泛存在于组织细胞膜表面，协助各种生理功能的执行，并与细胞内环境的稳态及细胞的增殖有关。研究发现，钾离子通道在肺癌、乳腺癌、前列腺癌中大量过表达，与肿
8、瘤的发生发展关系密切。G I R K 为内向整流钾离子通道，目前已知5 种不同类型亚基存在，其中G I R K l - 4 于哺乳动物细胞表达，G I R K 5 于爪蟾卵母细胞中发现【5 8 】。研究报道G I R K l 蛋白在乳腺癌组织中呈过度表达，并与临床分期存在明显相关性【9 】。在应用R T - P C R 法研究肺癌组织样本中，G I R K l 基因也呈过度表达，且与淋巴结的转移明显相关f 4 1 。目前，国内外关于G R K l 蛋白在肺癌活体组织中的表达情况，及其与临床资料的关系尚无报道。本研究将检测肺癌组织中G I R K l 蛋白的表达情况，及其与临床资料之间的关系。材
9、料与方法一、标本来源收集中国医科大学附属盛京医院胸外科2 0 0 5 年1 月至2 0 0 5 年1 2 月期间手术6切除肺癌标本6 0 例，其中男性4 5 例，女性1 5 例，年龄2 1 7 4 岁，中位年龄5 4岁。全部病例术前均未经任何治疗，术后根据世界卫生组织关于肺癌的组织学诊断标准明确诊断。标本离体后尽快取材，1 0 甲醛固定2 4 h ，取材组织厚4 m m ，常规组织处理、石蜡包埋，制成目标蜡块，做4um 组织切片。二、主要试剂兔抗人G I R K l 多克隆抗体( a n t i K i r 3 1 ) 购自A l o m o n eL a b s 公司，P V - 9 0 0
10、 0试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，氨基联苯胺( D A B ) 显色试剂盒购自福州迈新生物公司。三，免疫组织化学染色用P V - 9 0 0 0 二步法，兔抗人G I R K l 多克隆抗体工作浓度为l ：2 0 0 。P B S 代替一抗做阴性对照。主要染色步骤如下：( 1 ) 7 2 “ C 烤片机连续烤片6 小时( 2 ) 二甲苯( I 、I I 各3 5 分钟) 、乙醇系列( 无水I 、无水I I 、9 5 I 、9 5 I I 各5 分钟) 脱腊至水，蒸馏水3 m i n x2 次，P B S 洗3 m i n x3 次( 3 ) 柠檬酸修复液高压修复1 8 0 秒，使抗原位点充分
11、暴露，自然冷却至室温，蒸馏水5 m i n 2 次，P B S 洗5 m i n 3 次( 4 ) 3 过氧化氢封闭3 5 分钟，封闭内源性过氧化物酶，蒸馏水5 m i n X 2 次，P B S 洗5 m i n 3 次( 5 ) l0 牛血清室温封闭3 0 分钟，以降低背景非特异性着色( 6 ) 倾去血清，不水洗，滴加一抗( G I R K l 工作浓度为1 ：2 0 0 ) ，室温孵育l小时，4 冰箱过夜( 7 ) 次日晨P B S T 洗5 m i n 3 次，滴加P V - 9 0 0 0 试剂盒试剂l ( 聚合物辅助剂) ，3 7 温箱孵育3 5 分钟，P B S T 洗5 m i
12、 n X 3 次( 8 ) 滴加P V - 9 0 0 0 试剂盒试剂2 ( 辣根酶标记羊抗兔d , 鼠l g G 多聚体) ，3 7 。C温箱孵育4 5 分钟，P B S T 洗5 r a i n 3 次( 9 ) 滴加D A B 显色液，显微镜下控制显色，蒸馏水终止显色，蒸馏水洗5 m i n73 次( 1 0 ) 苏木素复染2 0 分钟、盐酸酒精分化4 秒，返蓝2 0 m i n( 11 ) 梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。实验设P B S 代替一抗为空白对照，预实验呈阳性表达的切片为阳性对照，作为质量控制标准。四、免疫组化结果判定G I R K l 阳性为棕黄色颗粒定位于
13、细胞膜，细胞浆也有少量表达。免疫组化结果由两位观察者采用盲法每个病例随机选择2 个高倍视野，计数2 0 0 个细胞，按照阳性细胞数占同类细胞数的比例，进行等级划分。结果采用半定量计分方法，根据细胞染色强度( A ) 和染色细胞所占的比例( B ) 两者乘积来判定。即：( A ) ：染色强度按下列标准评定记分：O 分为无色；1 分为浅黄色；2 分为棕黄色；3 分为棕褐色。( B ) ：染色的阳性细胞占比例按下列标准评定记分：0 分为阴性细胞或弱阳性细胞 7 5 。两种评分相乘( A X B ) ，将结果分为：0分为阴性( 一) ；l 4 分为弱阳性( + ) ；5 “ - - 8 分为中度阳性(
14、 抖) ；9 - 1 2 分为强阳性( H 斗) 。五、统计学处理采用S P S S l 3 0 软件包进行分析。本实验数据分析采用行列表的x2 检验、F i s h e r 确切概率检验，P o 0 5 ) 。图1 A 、1 B 分别为G I R K I 在鳞状细胞癌中的表达X 2 0 0 、X 4 0 0 。图l C 为G I R K l在脱落的癌组织中的表达。图I D 为G I R K l 在腺癌中的表达。9表1 ，G I R K l 表达与肺癌临床病理因素的关系组别例数G I R K l 表达一+ + + +阳性率rP注：鼢 盯确切概率法1 0讨论钾离子通道是细胞膜上种类最多，分布最广
15、的一类离子道，与细胞膜电位形成、激素分泌、兴奋性、基因表达及细胞的增殖和凋亡有着密切的关系。近年来随着分子生物学技术的发展，实验证实，钾离子通道广泛分布于各种肿瘤细胞膜上，并与肿瘤的发生、发展密切相关。电压门控钾离子通道( E A G ) 在肿瘤细胞中起增殖作用【1 0 m 】，P a r d o 等发现阻止E A G 的表达可以明显减少细胞的增殖，促进E A G 的表达可刺激肿瘤细胞的生长。并有文献报道H E R G 钾离子通道在结肠粘膜正常组织细胞中无表达，而在直结肠癌组织细胞中高表达【J 3 】。钙激活钾通道( K C a )在前列腺癌、神经母细胞瘤和成神经管细胞瘤瘤细胞的增殖中发挥重要生理调控作用。最近B l o c
