《ING5、CXCL16CXCR6在胃癌侵袭、转移中的作用及相关分子机理研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ING5、CXCL16CXCR6在胃癌侵袭、转移中的作用及相关分子机理研究（80页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、I N G 5 、C X C L l 6 C X C R 6 在胃癌侵袭、转移中的作用及相关分子机理研究I n v e s t i g a t i o no ft h ee f f e c t sa n dm o l e c u l a rm e c h a n i s m so fI N G 5a n dC X C L16 C X C R 6o nt h ei n f i l t r a t i o na n dm e t a s t a s i sd u r i n gg a s t r i cc a r c i n o g e n e s i s导论文课题起止时间：2QQ 2 生兰月二至
2、Q ! Q 生! Q 月论文完成时间：2Q ! Q 生! 至月中国医科大学( 辽宁)20 12 年5 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一阗相关责任。论文作者签名：阻日期：礁鱼业中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识
3、产权的规忌即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：目录一、摘要中文论著摘要一1英文论著摘要一6中文论著摘要二1 4英文论著摘要二2 0二、英文缩略语2 7三、论文论文一2 8前言2 8刖吾二。材料与方法2 9实验结果3 2讨论4 2结论4 4论文
4、二4 5前言4 5日舌。7材料与方法4 6实验结果4 9讨论5 8结论6 0四、本研究创新性的自我评价6 2五、参考文献6 3六、附录综述6 8在学期间科研成绩7 5致谢7 6个人简介7 7中文论著摘要论文一I N G 5 蛋白核浆移动与胃癌侵袭、转移的相关性研究目的胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，虽然近年发病率有所下降，但仍然严重威胁人类健康。虽然化疗、放疗、生物治疗和基因治疗在胃癌治疗中广泛应用，但胃癌侵袭和转移仍然是生存率无法大幅提升的主要原因。近年来分子遗传学研究证明，胃癌是异型性极强的恶性肿瘤，胃癌发生和发展是多阶段、多基因和多因素参与的复杂过程，这些基因主要包括癌基因、抑癌基因及
5、D N A错配修复基因等。其中基因突变、杂合性丢失和启动子甲基化修饰等导致抑癌基因功能降低或缺失在肿瘤发生和演进中发挥重要作用，成为肿瘤学研究的一个热点，其中之一就是生长抑制基因( I n h i b i t o ro f g r o w t h ，I N G ) 家族。生长抑制基因( I N G ) 包括5 个家族成员。其中，I N G 5 定位于人染色体2 q 3 7 3 ，含有8 个外显子和7 个内含子，编码长为5 2 3 3b p 的e D N A 中1 0 6 8 个核苷酸翻译成由2 4 0 个氨基酸组成的2 8 k D a 蛋白质。从氨基到羧基末端I N G 5 蛋白含有亮氨酸拉链
6、样( L Z L ) 、新保守区( N C R ) 、核定位序列( N L S ) 和植物同源结构域( P 皿) 。L Z L 结构域在D N A 修复、凋亡诱导和染色质重建中发挥重要作用，N C R 结构域在基因表达和染色质重建过程中参与组蛋白乙酰转移酶( H A T )复合体形成，N L S 结构域决定了I N G 5 蛋白核定位。因其具有抑制细胞生长并以p 5 3 蛋白依赖方式诱导细胞凋亡的生物学作用，I N G 5 被认为是一种抑癌基因。I N G 5 可诱导p 5 3 蛋白乙酰化，在乙酰化p 5 3 蛋白协同作用下形成H A T 复合体或激活微染色体维持蛋白( M C M ) ，分别
7、在调节细胞S 期D N A 复制或组蛋白乙酰化中发挥作用。有研究显示，I N G 5 可以通过调节p 5 3 蛋白激活周期素依赖激酶抑制剂p 2 1 w a f l 启动子活性促进p 2 1 其表达，进而导致细胞G 1 期阻滞。很多研究发现，恶性肿瘤发生过程中存在I N G 蛋白下调或者缺失，癌细胞中I N G 表达参与凋亡调节。许多体内外实验也发现I N G 蛋白调节细胞凋亡的作用。I N G 5 的过表达可以导致集落形成效能的降低和S 期细胞的减少，并且以P 5 3 依赖的方式诱导细胞凋亡。我们之前的研究显示结肠癌中I N G 5 蛋白或m R N A 组织含量升高，两者癌变过程中核I N
8、 G 5 蛋白发生了浆移动和表达下调，核I N G 5 表达与肿块大小、侵袭深度、去分化、临床病理分期或不良预后呈负相关，而浆I N G 5 表达与肿瘤侵袭深度、淋巴管侵袭、淋巴结转移或临床病理分期呈正相关。随着诊断和治疗技术的不断提高和广泛开展，胃癌的发病率和病死率在全世界范围均有所下降，但是胃癌仍是威胁人类的高发恶性肿瘤之一，而且病死率仍排在第二位。病理和遗传学研究提示胃黏膜上皮不典型增生大部分最终要恶变，然而，其分子机制尚未阐明。因此，我们推测I N G 5 表达异常在胃癌发生和演进中发挥重要作用。本文研究了I N G 5 在胃正常粘膜、不典型增生、癌组织和胃癌细胞系中的表达，并进行临床
9、病理学资料分析和预后分析，以期发现I N G 5 在胃癌进展过程中作用。方法一、细胞培养：五种胃癌细胞系，M K N 2 8 ( 高分化腺癌) 、M K N 4 5 ( 低分化腺癌) 、A G S( 中分化腺癌) 、K A T O I I I ( 低分化腺癌) 和G T - 3 ( 未分化腺癌) 受赠于日本理化研究所。其中，M K N 2 8 、M K N 4 5 和K A T O I I I 在R P M I16 4 0 培养液中培养，G T - 3 在D M E M 中培养，A G S 在H a m s F 1 2 中培养，每种培养液中均：J 1 1 0 F B S ，浓度为1 0 0u
10、n i t s m l 。所有细胞经过收集、离心、P B S 洗涤，然后提取总蛋白。细胞蛋白在应用核浆蛋白分离试剂盒分离( 7 8 8 3 3 ；P i e r c eB i o t e c h n o l o g y ,R o c k f o r d I L ) 。再次收集细胞，经过离心、P B S 洗涤后，置入1 0 甲醛中固定，然后进行石蜡包埋，用于进一步实验。二、胃癌标本的收集胃癌石蜡标本来自于中国医科大学附属第一医院肿瘤外科1 9 8 5 年至2 0 0 3年手术切除病例和K o u s e r e i nT a k a o k aH o s p i t a l l 9 9 3 年至
11、2 0 0 2 年的手术切除病2例，其中胃癌组织( G C ) 4 2 9 例，癌旁非癌组织( N N M ) 1 1 9 例。另外还有5 0例不典型增生来自中国医科大学附属第一医院内窥镜中心1 9 9 0 年至2 0 0 9 年的活检标本。另外还收集临床手术新鲜标本2 1 例，包括癌组织和相对应的癌旁非癌组织，标本置于8 0 0 C 深低温冰箱保存直至实验所用。所有病例术前均未经过放化疗和其他辅助治疗。我们对每例患者进行电话随访。三、病理学检查及组织芯片( ti8 8 U em io r o a r r a y ，T 卧) 的制备所有蜡块均切成4 - 1 11 1 1 厚的切片，然后进行H
12、E 染色，镜下确定组织学诊断和其他镜下特点。镜下确定每例切片的目的区域，然后再组织芯片机上制成2 m m 直径组织，放于组织芯片盒内( T M A ；A Z U M A Y AK I N 1 ，T o k y o ，J a p a n ) ，之后对芯片盒内的组织在进行石蜡包埋，最后切成4 um 的切片进行免疫组化实验。四、蛋白印记( W e s t e r nb I o r ) 检测I N G 5 的蛋白水平( 1 ) 将收集的病理标本，加裂解液( 2 0m m o l LT f i s H c lP H ：7 5 ，5 0 m m o l L N a c l ，0 1 m m o l LN
13、a 3 V 0 4 ，2 5m m o l LN a F ，2m m o l LE D T A E G T A ，l m m o l LD T T ，l m g l L 亮肽酶抑肽酶) 2 0 0uL ，冰上放置3 0 m i n ，超声破碎2 0 s e c 次，3 - 4 次。1 2 0 0 0 r p m 离心2 0 m i n 取上清，即为总蛋白。( 2 ) 收集细胞，用预冷的P B S 洗涤2 次，1 0 0 0 r p r n m i n 离心5 r a i n 弃上清。同上方法提取总蛋白。( 3 ) 考马斯亮蓝法测定蛋白含量，取9 0 l ag 总蛋白上样，经1 0 S D S
14、- P A G E 凝胶电泳分离蛋白后将蛋白电转移到N C 膜上。根据分子量裁膜。5 脱脂奶粉室温封闭1 h ，加入I N G 5 一抗( 1 ：10 0 0 ) 4 “ C 过夜，辣根过氧化酶标记的二抗室温作用1 h 。每次孵育后均用含5 的T w e e n 2 0 的T B S 洗脱3 次，每次5 m i n 。待N C 膜稍干后，在膜上滴加适量的E C L 显影并上机扫描测灰度值。每组实验至少重复3 次。( 4 ) 最后，用S t r o n gB 硼f e r 液洗膜，在加入内参1 3 a c t i n 单克隆抗体( 1 ：1 0 0 0 ) 孵育，按上述步骤显影并测灰度值，进行统计学分析。五、R T - P C R 、电泳& 测序以提取并反转录的e D N A 为模板扩增目的基因：2 5uL 反应体系含有T a
