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1、RNAi 技术技术1. RNAi 定义RNA 干扰（RNA interference，RNAi）1是由双链 RNA（double stranded RNA，dsRNA）分子在 mRNA 水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。dsRNA 可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。因此，RNAi 技术又被形象地称为基因敲除（knock out）或基因沉默（gene silencing）。RNAi 是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS）。RNAi 现象广泛存
2、在于生物界中。它在真菌中被称为 quelling，在拟南芥、烟草等植物中被称为 PTGS 或共抑制（cosuppression），在无脊椎动物如果蝇、水螅、线虫以及脊椎动物斑马鱼、小鼠等动物界中被称为RNAi。PTGS 可能是生物界，包括植物和动物等普遍存在的一种古老、保守而又极其重要的遗传行为。RNA 干涉是生物基因组抵抗转座子或病毒之类的外来遗传元件入侵的一种保护性机制，具有以下 4 个重要特征：RNAi 属于转录后水平的基因沉默(PTGS) 机制，迄今为止的研究认为 RNAi 对染色体 DNA 序列的复制和转录过程不产生任何影响； 具有高度的序列特异性，最近将人工合成的 siRNAs （
3、短小 RNA，是 RNi 过程中直接起作用的分子）转入宿主细胞的实验表明，即使 siRNAs 中只有一个碱基与靶序列错配，也会使干涉效应大大减弱； 具有抑制基因表达的高效性, 可以引起该基因缺失突变的表型；而且远远少于内源 mRNA 数量的 dsRNA 就可以实现完全的抑制效应, 即其发生过程中存在着正反馈的信号放大效应；RNAi 的效应可以在不同细胞间长距离传递和维持，而且在某些生物中(比如线虫) 具有遗传性。2. RNAi 的发现与探索1995 年康乃尔大学的 Guo2博士在实验中想通过反义 RNA 阻断美丽线虫(C.elegans)的par-1 基因表达，同时她还用正义 RNA 做了一个
4、对照，试图观察到对照试验组基因表达增强的现象，但结果却发现了反义和正义 RNA 都阻断了该基因的表达。GUo 等人一直不能解释该现象。直到 1998 年 Fire1等才发现这是由于 Guo 博士在试验中污染了双链 RNA而引起的(他们还证明转录得到的单链 RNA 经纯化后注射线虫所引起的阻断作用十分微弱，而经纯化的双链 RNA 则能高效特异地阻断相应基因的表达，他们将此称为 RNA 干扰。RNAi 潜在的作用促使 Fire 和 Timmons 继续实验，将能够表达出与 C.elegans unc-22 基因同源的双链 RNA 的细菌喂食线虫，结果线虫表现出类似 unc-22 缺失的表型3。后继
5、的实验表明将线虫浸在 RNA 中同样可诱使基因沉默。这种技术使得大规模筛选线虫 RNAi诱导的功能缺失突变体成为可能，并引发出随后大量针对这种模式生物基因敲除的研究。目前正在应用 RNAi 技术对线虫中几乎所有的在基因组中预测的约 19000 个基因的功能进行研究。1999 年，Hunter4 等的实验进一步验证了 RNAi 的存在。他们将 dsRNA 去除后，再将正义或反义的 ssRNA 注入线虫卵中，没有产生基因沉默现象。相反，如果将上述正义及反义 ssRNA 混合，经退火复性后得到的 dsRNA 注入线虫卵中可以显著地产生基因沉默现象，从而印证了 Fire 等提出的 RNAi 作用是由
6、dsRNA 引起的结论。1 Fire A , Xu S , Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabdits elegans. Nature , 1998 , 391：806-8112 Guo S, Kempheus KJ. Par-1, a gene required for establishing polaring in C.elegans embryos, enkinase that asymmetrically distribut
7、ed. Cell, 1995,81:6113 Timmons I, Court D, Fire A. Ingestion of bacterially expressed dsRNA can produce specifie interference in C.elegans. Gene,2001,263:1034 Hunter, Craig P. Genetics: A touch of elegance with RNAi. Current Biology,1999,9(12):440RNAi 的作用机制的作用机制3 RNAi 的作用机制3.1 RNAi 的作用体现在两种水平上转录水平。R
8、NA 可以介导 DNA 的甲基化(RNA-directed DNA methylation ,RdDM) 最早发现于一种植物的类病毒系统。dsRNA(double-strand RNA) 被降解成 2123 个核苷酸长的小片段 RNA 时，这些小的 RNA 分子在细胞核可以诱发同源序列的 DNA 甲基化5 。这种序列特异性的甲基化的信号与 RNA-DNA 结合有关6 。当 dsRNA 含有与启动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默。非致病病毒的造成转录水平基因沉默相关的 RdDM 最先发现于以菜花样花叶病毒，其 35S 启动子转录得到含有胭脂碱合
9、成酶启动子(NOSpro) 序列的NOSproRNA。在转基因烟草中，据报告未腺苷酸化的 NOSpro dsRNA 可以诱导同源NOSpro DNA 的甲基化，并使拷贝在转录水平上反式失活。在链胞霉属，DNA 的甲基化可能是异染色质的 siRNA 介导的组蛋白 H3 K9 的甲基化，是由 H3 甲基转移酶催化的7 。转录后水平。特异切割 dsRNA 的 RNA 酶家族核酸酶 Dicer 依赖 ATP 切割dsRNA ，将其分解成具有 2 个核苷酸的 3悬端(overhang) 的 1921b 小片段的双链siRNA。RISC(RNA 诱导的沉默复合物 RNA-induced silence c
10、omplex) 识别并降解mRNA。RISC 是一种蛋白-RNA 效应器核酸酶复合物。双链 siRNA 为 RISC 的重要组分，它依赖 ATP 解旋导致 RISC 活化，然后通过 Waston-Crick 碱基配对识别底物mRNA 并与之结合，并自 siRNA 的 3端将 mRNA 切割成小于 12nt 的片段使其降解8 。对一些人组织因子的试验表明，几个不同的 siRNA 可以攻击同一个 mRNA 的不同位点。只有一部分 siRNA 会导致显著的基因沉默，这说明在人 mRNA 上的siRNA 结合位点可能很少，且不活跃的 siRNA 与活跃的 siRNA 可逆性竞争9 。3.2 miRNA
11、 Dicer 酶产生两类功能特异的小分子 RNA：siR2NA 和 miRNA(micro-RNA)。Tuschl 等在从果蝇胚胎提取物的长的 dsRNA 处理得到 siRNA 的同时，得到了 16 种 2023个核苷酸大小的短的单链 RNA。这些 RNA 由果蝇基因组编码并在 02 周的胚胎内表达。它们具有潜在的调节基因表达的作用，被称为 miRNA10 。miRNA 约 21 个核苷酸大小，为单链结构，大多数 miRNA 与底物 mRNA 不完全配对结合，它们并不改变 miRNA 的稳定性，而是通过抑制翻译来使基因沉默11 ，但目前至少发现一种植物miRNA(miR171) 与底物 mRN
12、A 完全配对，这提示了 miRNA 通过 RNAi 途径调节基因表达的可能性12 。与 siRNA 不同的是，由于 miRNA 为单链结构，其作用不需要ATP 的存在。3.3 RNAi 的放大效应由于 RNAi 的机制在生物体的效应极其显著，有研究提示，RNAi 通路应该有相应的放大步骤。放大效应可能的途径：通过复制 dsRNA 或者 siRNA 进行。Nishikura 提出“过渡的 RNAi (transitive RNAi) ”的机制，即由原先的靶序列的上游序列延伸形成新的siRNA，继续降解同源的基因家族成员或者切割 mRNA13 。多轮的 RISC 效应。RdRP(RNA 诱导的 R
13、NA 多聚酶) 的作用:植物和新秀丽小杆线虫的 dsRNA 诱导的沉默都需要与 RdRP 相似的蛋白质的参与8 。RNAi 一般在体细胞发挥作用，在ego21 表达的生殖细胞一种称为“随机降解 PCR”的放大模型却提示 RdRP 通过 siRNA 引导链识别并结合 mRNA，产生一种双链 RNA 的 Dicer 酶底物，以产生更多的siRNA。5 Mette MF ,Matzke AJ ,Matzke MA. Resistance of RNA-mediated TGS to HC2Pro ,a viral suppressor of PTGS , suggests alternative p
14、athways fordsRNAprocessing .CurrBiol ,2001 ，11(14) :1119-1123.6 Mette MF ,Aufsatz W,van der Winden J , et al . Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA . EMBO J ,2000 ,19(19) :519425201.7 Tamaru H , Selker EU. A histone H3 methyltransferase controls DNA met
15、hylation in Neurospora crassa . Nature ,2001 ,414 (6861) : 277-283.8 Hannon GJ . RNA interference . Nature ,2002 ,418 (6894) :244-251.9 Holen T ,Amarzguioui M,Wiiger MT , et al . Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor . Nucleic AcidsRes ,20
16、02 ,30(8) ：1757-1766.10 Lagos2Quintana M, Rauhut R ,Lendeckel W, et al . Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science ,2001 ,294(5543) :853-858.11 Zeng Y,Wagner EJ ,Cullen BR.Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells .MolCell ,2002 ,9(6) :1327-133312 Hutvagner G, Zamore PD. A microRNA in a multiple2turnover RNAi enzyme complex . Science ,2002 ,297 (
