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1、I L 一2 1 对H I V 感染者调节性T 细胞的作用研究E f f e c t so fi n t e r l e u k i n21o nr e g u l a t o r yTc e l li nH I Vi n f e c t i o n巳寸一级学科：鳖鏖匡堂 二级学科：堕廛捡坠途逝堂论文课题起止时间：2 Q ! Q 生! Q 月二2 Q 1 2 生圣旦中国医科大学( 辽宁)2 012 年3 月IYltlt l l l 2 l l l l l l o l l t l l 9 l l t l t l l l l l l l l 9 l l l l l l 8 l t l l11)jl
2、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：墨塾魄。日期：仞z 、文2 ，中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕
3、业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。f ，论文作者签名：鱼塾丝指导教师签名：盗兰圣日期：竺! 三：至目录一、摘要中文论著摘要：1英文论著摘要7二、英文缩略语15三、论文嘀i f 言1 0 日U 茜17 ：材料和方法1 7实验结果：2 3讨论3 2结 仑3 5四、本研究创新性的自我评价3 6五、参考文献。j 一3 7六、附录综述4 l，在学期间科研
4、成绩5 2致谢一5 3个人简介5 4中文论著摘要I L 2 1 对H I V 感染者调节性T 细胞的作用研究目的艾滋病( A I D S ) 又名获得性免疫缺陷综合症( A c q u i r e di m m u n ed e f i c i e n c ys y n d r o m e ) ，是由人类免疫缺陷病毒( H I V ) 引起的一种严重传染病。高效抗逆转录病毒治疗( h i g h l ya c t i v ea n t i r e t r o v i r a lt h e r a p y , H A A R T ) 虽然能降低病毒载量，延缓H I V 感染的疾病进程，但治疗后部
5、分患者免疫重建不佳。如何有效恢复T 细胞的功能，增强机体免疫系统的抗病毒能力，对于H I V 感染免疫治疗及疫苗研究具有重要意义。白细胞介素2 1 ( I L 2 1 ) 是共用丫链( 丫c ) 细胞因子的新成员，在免疫应答中发挥重要作用。在H I V 感染中，I L 。2 1 可显著增加C D 8 + T 细胞穿孔素及粒溶素等抗病毒功能，更重要的是，其发挥功能的同时，不加重机体的免疫激活，对增强抗H I V 免疫应答，抑制免疫活化及免疫重建具有重要意义，被认为是有希望应用到H I V 感染临床治疗及疫苗佐剂研究的重要因子。I L 2 l 的临床治疗发展的最大障碍，亦是决定因素，在于I L 2
6、 1 所带来的免疫效应能否转化为病死率和发病率的降低，能否改善疾病的转归。例如，在应用I L 2 治疗H I V 感染者的临床实验中，尽管C D 4 + T 细胞的数量显著增加，但由于I L 2 能扩增T r e g 亚群，导致免疫功能受到抑制，患者存活率没有改善。调节性T 细胞( r e g u l a t o r yTc e l l ，T r e g ) 抑制免疫激活，也抑制免疫细胞功能，是免疫系统的重要调节因子之一。细胞因子对T r e g的影响在其应用于H I V 感染治疗及疫苗中不可忽视，明确I L 一2 1 对H I V 感染者T r e g 的影响对其应用具有重要意义。H I V
7、 感染中，I L 2 1 对T r e g 的直接影响尚无报道，明确其对T r e g 的影响对其在H I V 感染治疗中的应用具有重要意义。作为共用丫c 细胞因子家族的成员，I L 7 及I L 1 5 在肿瘤的临床治疗中发挥作用，亦应用到H I V 感染治疗，但其对T r e g 的影响研究结果尚不一致。H I V 感染中，I L 7及I L 1 5 对T r e g 的直接影响尚无报道，I L 一2 1 对T r e g 影响与I L 一2 、I L 一7 及I L 一1 5作用的差别亦无报道。本研究对H I V 感染者I L - 2 1 及T r e g 在疾病进展中的变化进行研究，并
8、分析I L - 2 1 对T r e g 凋亡，增殖及其效应分子C T L A 一4 和T G F B 的影响，与其它共用丫c细胞因子作用对比，明确H I V 感染者I L 一2 l 与T r e g 的相关性及I L 一2 1 等共用Y c。细胞因子对T r e g 的影响，为进一步明确H I V 的致病机制及艾滋病的免疫治疗提供线索。方法l 、研究对象5 8 例无症状H I V 慢性感染者( H I V ) 均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊，感染途径多为男男性接触，感染时间一年以上，在检测时间点均未接受H A A R T 治疗( 检测发现C D 4 + T 细胞数量低于3 5 0
9、个u l 或出现艾滋病指征性疾病均接受治疗) 。2 5 例健康对照为随机抽取的H I V 抗体阴性、未暴露于H I V 的健康人( N C ) ，H I V 及N C 组年龄、性别经检验均无显著性差异。本研究内容获得参加者的书面知情同意。2 、T r e g 细胞比例、绝对值检测两管i x l 0 6P B M C 中加入a n t i C D 3 P e 疋P 、a n t i C D 4 A P C C Y 7 、a n t i C D 2 5 P E C Y 7 及a n t i C D 3 P e r C P 、a n t i C D 4 A P C C Y 7 、a n t i C
10、D 2 5 P E C Y 7 、a n t i C D l 2 7 A P C 标记的荧光抗体，冰上避光染色，洗涤细胞，前一管按F o x p 3细胞破膜染色试剂盒标准操作进行细胞破膜、胞内染色( a n t i F o x P 3 A P C 标记的荧光抗体) ，洗涤并固定细胞。使用B DL S R I I 流式细胞仪及B DF A C S D i v a T M 软件检测并分析T r e g 细胞占C D 4 + T 细胞的比例，计算其与该样本的C D 4 + T 细胞绝对值检测结果的乘积即得到T r e g 细胞绝对数量。3 、C D 4 + I L 2 1 + T 细胞检测提取P B
11、 M C ，与P M A 、I o n o m y c i n 及G o l g i S t o p 共培养6 小时。用P B S 沈涤P B M C 后，加a n t i C D 3 P e r C P 及a n t i C D 8 F I T C ，避光染色，用P B S 洗涤后，细胞破膜，加a n t i I L 2 1 P E ，避光染色，洗涤细胞后，固定细胞，F A C S A r i a 流式细胞仪D i v a 软件进行分析。以F S C 、S S C 、C D 3 P e r C P 、C D 8 F I T C 定义C D 4 + T 细胞( C D 3 + C D 8 T
12、细胞) ，分析I L 2 1 的表达。24 、C D 4 + C D 2 5 + C D l 2 7 1 0 w 一T r e g 及C D 4 + 、C D 8 + T 细胞增殖提取人P B M C ，用2 u MC F S E 标记P B M C ，用重组I L 2 l 、I L 2 、I L 7 、I L 1 5及a n t i C D 3 刺激培养5 天，a n t i C D 3 P e r C P 、a n t i C D 4 A P C C Y 7 、a n t i C D 2 5 P E C Y 7 、C D l 2 7 A P C 标记的荧光抗体冰上避光染色，洗涤，流式检测C
13、 D 4 + C D 2 5 + C D l 2 7 1 0 w - T r e g 及C D 4 + 、C D 8 + T 细胞增殖。5 、C D 4 + C D 2 5 + C D12 7 l o w T r e g 及C D 4 + C D 8 + T 细胞凋亡提取人P B M C ，用重组I L 2 1 、I L 2 、I L 7 、I L 1 5 及a n t i C D 3 刺激培养3 天，a n t i C D 3 A P C C Y 7 、a n t i C D 4 F I T C 、a n t i C D 2 5 P E C Y 7 、C D12 7 A P C 标记的荧光抗
14、体冰上避光染色，洗涤，之后加入a n t i A n n e x i nV - P E 及a n t i 7 A A D ，室温避光染色，流式检测C D 4 + C D 2 5 + C D l 2 7 1 0 w T r e g 细胞及C D 4 + C D 8 + T 细胞上A n n e x i nV 及7 - A A D 的表达量，1 h 内检测完成。6 、C D 4 + C D 2 5 + C D l 2 7 1 0 w T r e g 上C T L A 一4 的表达提取人P B M C ，用重组I L 一2 1 、I L 2 、I L 7 、I L 1 5 及a n t i C D 3 刺激培养3 天，a n t i C D 3 P e r C P 、a n t i C D 4 A P C C Y 7 、a n t i C D 2 5 一P E C Y 7 、C D l 2 7 A P C 标记的荧光抗体冰上避光染色，洗涤，细胞破膜，加a n t i C T L A 4 P E ，避光染色，洗涤细胞后，细胞固定，F A C S A r i a 流式细胞仪D i v a 软件进行分析。7 、C D 4 +
