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1、参考文献( 略)不同中医治法对不同肝癌细胞株的作用比较 管鲁元方肇勘镰海选吴中华上海中医药大学基础医学院( r 海2 0 1 2 0 3 )原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。中医药在改善患者症状体征，提高患者生活质量，控 制瘤体生艮，延长患者生存期等方面具有独到的优势，已越来越受人们的重视。通过对近二十年中医文 献的整理研究表明，中医药防治原发性肝癌的治法集中在活血化瘀、清热解毒、健脾理气等三个方面， 其中活血化瘀药物在所有方剂组方中使用率为9 2 1 、清热解毒药物为8 4 2 、健脾理气药物为7 8 9 。清热解毒法( 清热方) 以半枝莲、白花蛇舌草、蒲公英等中药组成；活血化瘀法( 活
2、血方) 以丹参、 桃仁、赤芍等中药组成；健脾理气法( 健脾方) 以黄芪、太子参、白术等中药组成【1 1 。本科题组多次动 物实验发现，三种常用中医治法中药对肝癌瘤体及带瘤机体的作用不尽相同，其中清热解毒中药对肿瘤 的抑制作用最明显。为了进一步比较不同中医治法对原发性肝癌的作用差异，我们以人原发性肝癌 S M M C 7 7 2 1 细胞、B e l 7 4 0 2 细胞为模型1 2 “，比较不同治法对两种细胞株增殖的抑制作用。 l 实验材料与方法 1 1 中药的制各 中药浸泡1 2 小时，旺火煮沸，文火煮半小时，取药液：再加水，旺火煮沸，文火煮半小时，取药 液，将两次药液合并，浓缩至所需生药浓
3、度( 按生药计算) 。再按体积比2 ：3 加入无水乙醇，4 “ C 静置 4 8 小时，离心机2 0 0 0 r p m 离心，取上清，浓缩药物至2 9 m l ，微孔滤膜过滤，4 “ C 保存。1 2M T T 法测定细胞方法的建立取对数生长期的肿瘤细胞，0 2 5 胰蛋白酶消化，计数细胞，稀释成不同浓度梯度的细胞悬液，然 后取9 0 9 l ，加入到9 6 孔板上，每个样品设3 个复孔，3 7 ，5 C 0 2 培养8 小时后，加入5 m g m l M T T l o g l ， 培养4 h 后，吸弃上清溶液，加入1 0 0 p , I D M S O ，振荡1 0 m i n ，使其充
4、分混匀，酶标仪上测定其吸光度， 吸收波长为5 7 0 n m 对照波长为6 3 0 n m 。 1 3 不同治法对不同肿瘤增殖的作用 取对数生长期的肿瘤细胞，o 2 5 胰蛋白酶消化，计数细胞，稀释成适当浓度的细胞悬液，然后取 9 0 p , 1 ，加入到9 6 孔板上，在3 7 ，5 C 0 2 培养适当时间后，细胞处于对数生长期时加入不同浓度( 按 生药总量计算) 的治疗药物1 0 山，5 F u 的浓度为1 0 0 p , g m l ，空白对照加入P B S 溶液1 0u l ，培养4 8 小 时后，酶标仪测定其吸光度，吸收波长为5 7 0 n m ，对照波长为6 3 0 n m 。
5、1 4 统计分析：方差分析。 2 实验结果 2 1 不同治法中药直接加入培养基对S M M C 7 7 2 1 肝癌细胞株增殖的抑制作用 由表l 中我们可以看出随着浓度的增大，清热解毒中药和活血化瘀中药对S M M C 7 7 2 1 细胞的抑制 作用增强，具有明显的量效曲线；而健脾理气中药各浓度之间没有明显的抑制作用( p O ，0 5 ) 。在2 5 ， 5 0 ，7 5 m g m l 的浓度下，清热解毒中药的抑制作用 活血化瘀 健脾理气中药( p 活血化瘀中药 健脾理气中药( p O 0 5 ) ，但单用清热解毒中药比与其他治法合用要好。 表3 清热解毒中药与其他治法配伍对S M M
6、C 7 7 2 1 细胞株作用( 吸光度M + S D )堕鎏! 垫塑蓬堡垄! ! ! 坦塑! !型熬墼娄堡清热解毒40 0 2 8 4 - O 0 2 0 4 5 清热解毒+ 健脾理气40 0 3 6 ：t ：0 0 2 3 5 4 清热解毒+ 活血化瘀400 4 8 ：t ：0 0 2 4 9 5 清热解毒+ 健脾理气+ 活血化瘀40 0 5 3 O0 1 9 3 72 4 不同中医治法对细胞株B e l 7 4 0 2 肝癌细胞增殖的抑制作用 由表4 中我们可以看出随着浓度的增大，清热解毒中药对B e l 7 4 0 2 细胞的抑制作用增强，具有明显 的量效曲线：在浓度为2 5 m g
7、m l 时，而活血化瘀和健脾理气中药各浓度没有明显的抑制作用( p 0 0 5 ) 。 从表中可以看出浓度为为5 0 m g m l 时，活血化瘀可以促进肿瘤细胞的生长( p o 0 5 ) ，而健脾理气还是抑制肿瘤细胞的增 长( p O 0 5 ) ，但是都小于清热解毒的抑制作用( p 0 0 5 ) 。 表4 不同治法对B e l 7 4 0 2 肝癌细胞株的作用( 吸光度M S D )药物浓度例数清热解毒健脾理气活血化瘀! ! 型里! !对照组402 2 7 0 0 3 8 40 2 2 7 土00 3 8 40 2 2 7 00 3 8 42 540 1 2 8 00 4 8 3o2
8、3 l 0 0 5 1 50 3 1 5 0 1 0 6 95 040 0 1 0 士00 0 7 0 * 0 1 3 4 00 1 4 2 * 0 3 0 6 0 0 3 9 47 5400 0 8 士o0 0 2 5 * 0 1 5 8 00 3 5 4 * 0 2 0 8 士00 7 6 l1 0 0400 0 7 0 0 0 1 7 +o1 5 0 00 1 5 0 * 0 1 5 0 00 3 9 7 *+ 与对照组( 药物浓度为o ) 相比敖P O0 5 3 讨论 国内外的研究表明，活血化瘀、清热解毒、健脾理气等中医治法方药能提高原发性肝癌患者机体的 免疫功能、抑制肿瘤的恶性增长、
9、延长患者的生存期。但各医家在临床使用这些中医治法时，各人的体 会不一样，因此大家使用这些治法各有自己的侧重点而且各自的研究表明均取得一定的临床效果。由 于大家对肝癌“瘀”、“毒”、“虚”基本病机的认识是一致的，因此进一步研究这些中医治法的作用机理 及其作用靶点，将为指导临床用药具有一定的现实意义。 本研究表明，清热解毒中药无论是对S M M C 7 7 2 1 细胞，还是对B e l 7 4 0 2 细胞的增殖都具有较强的 抑制作用，且随着浓度的增大，具有明显的量效关系；而清热解毒法与其它两治法合用时，其效果却不 如单用清热解毒法，可能是由于合用后，稀释了清热解毒中药的浓度所致，这进一步充分说
10、明临床大剂 量使用这类中药是有充分的理论依据的。令人奇怪的是，在两种细胞株中，健脾理气中药能明显抑制 B e l 7 4 0 2 细胞的增长，而对于S M M C 7 7 2 1 肝癌细胞，健脾理气中药没有抑制作用；相反，活血化瘀中药 对S M M C 7 7 2 1 肝癌细胞有较好的抑制作用，而对B e l 7 4 0 2 细胞作用却不明显，甚至在低浓度时，具有 促进B e l 7 4 0 2 细胞生长的趋势。这可能提示不同肿瘤细胞对不同中医治法的敏感性不同，这是值得深入 研究的课题：如果确实存在这样特征的话，对肝癌的细胞鉴定结果将有助于指导中药的使用。这一结果 还提示，中医药的辨证论治有其
11、深刻的内涵，而这种内涵是需要大量的中医基础实验去予咀揭示的。 本研究进一步表明，清热解毒中药具有较好的细胞毒作用，能明显抑制不同人肝癌细胞株的增殖， 具有广泛开发抗肿瘤活性的一类中药口”。同时，活血化瘀中药也显示出一定的抗肿瘤作用。有人认为 活血化瘀的直接抑制肿瘤可能与所含丹参有关肾”l 。而健脾理气中药对不同人肝癌细胞株增殖的抑制作用具有明显的选择性，而且作用效果不如清热解毒和活血化瘀中药，这可能是由于健脾理气中药主要是 提高机体的免疫功能，而抑制肿瘤细胞的增殖作用不明显。 参考文献( 略)阴虚内热证动物实验研究概况 汪泳涛上海中医药大学基础医学院( 上海2 0 1 2 0 3 )阴虚内热是
12、中医学基本的病机理论和临床证型，曾经开展过大量的临床与动物实验研究，本文仅就 近期阴虚内热证的动物实验研究方面的概况进行综述和分析。 1 阴虚内热证的造模方法 1 1 氢考I 型法 昆明小鼠，雌雄各半，体重2 0 _ + 2 9 ，皮下注射氢化可的松l m g 只，隔日1 次，共3 次【1 1 ；S D 雄性 大鼠，于每日1 7 - 0 0 按5 m g 1 0 0 9 体重的剂量灌胃给予氢化可的松，连续4 天【2 - 3 】；C F W 系雌性小鼠， 7 - 8 周龄，每日后肢肌肉注射醋酸氢化考的松1 2 5 m g 只连续4 天口”。 1 2 甲状腺素法 纯种S D 雄性大鼠。肌注L T
13、4 ，, 5 m g J K g d ，连续7 天【4 l ；W i s m r 大鼠，雌雄不拘，皮下注射L - T 3 ， 剂量为5 0u g 1 0 0 9 体重，隔天一次，共3 次1 5 J ；s D 大鼠，体重2 2 3 - 2 3 0 9 ，T 3 1 8ug 只灌胃，连续5 天 6 1 ； 1 8 - 2 2 9 ，N I H 小鼠，雌雄各半，皮下注射T 4 0 4m g ，只，连续4 天【”；昆明雄性小鼠，体重1 8 - 2 2 9 ，灌服 T 3 1 8 ug ，只，连续5 天，s D 大鼠，雌雄不拘。灌服T 3 5 0 0 I , tg k g ，每日1 次，连续3 天【8
14、】；s D 大鼠i g 给予甲状腺素2 5m g k g d ，连续三周 9 1 ：s D 雌性大鼠，按5 0 0 ul k g 体重的剂量腹腔注射T 3 溶液。连 续7 天；C F W 系雌性小鼠，7 - 8 周龄，每日皮下注射L 甲状腺素钠盐0 4 m g 只，连续4 - 5 天【”1 。 1 3 甲状腺素合利血平法 雄性S D 小鼠，体重2 0 3 0 克，甲状腺素片每日每只3m g ，利血平每目每只O 0 2n l g ，研成粉末，以 生理盐水稀释，灌胃连续6 天；昆明小鼠，雌雄兼有，每日每只按甲状腺素3 0 0m g k g 、利血平2 r a g k g 的剂量灌胃连续7 天l l
15、2 】；昆明小鼠，雌雄各半，体重1 8 - 2 2 9 ，灌胃给予甲状腺素3m g 、利血平 0 0 2m g 只，每日1 次，连续l o 天I l “J 。1 4 温热药物法 雌性W i s t a r I I 大鼠，体重1 6 0 - 2 0 0 9 ，熟附子、肉桂、千姜各等份，常规制成2 0 0 浓度的煎剂( 附 子先煎) ，灌胃，4 m l 次只，每日1 次。连续1 6 天，第1 7 天开始，加用肉桂、干姜等份常规制成2 0 0 浓度的煎剂灌胃，4 m l 次只，每日2 次，持续至第2 8 天I l “。 I 5 二肾一夹高血压法 W i s t a r 大鼠，雌雄不拘，在戊巴比妥钠腹
16、腔注射麻醉下，切开腹中线，剥离左肾动脉，用内径0 2 m 的银夹夹窄左肾动脉，造成原发性高血压模型，原发性高血压临床最常见的证型为阴虚阳亢，因此把 原发性商血压模型作为阴虚内热证模型l J “。1 6 电刺激法 对动物连续间断电刺激几天，使动物疼痛不安1 1 。17 超负荷运动法 S D 雄性大鼠，游泳6 周，每周5 天，日游泳时间由l O 分钟逐日增加至第5 周末1 2 0 分钟持续一 周至造模结束。 2 阴虚内热证模型动袖的病理裹现与理机制 2 1 一般状况 体重下降【8 、9 、1 1 、1 2 、1 3 、1 5 、2 0 】；体温变化的观察结果不一，甲状腺素合利血平法模型有体温 升高，而温热药物法模型体温下降；甲状腺素法模型观察到日饮水量增加，日尿量减少唧：而温热 药物法模型饮水量无变化l
