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1、内蒙古医学院硕士学位论文原发性高血压患者血浆Apelin-12含量变化及意义姓名：谢秀峰申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：崔晓迎;苏乌云20090501中文摘要目的通过检测原发性高血压( E H ) 患者血浆A p e l i n 1 2 的含量，探讨血管活性物质A p e l i n 在原发性高血压中的作用及意义。方法搜集E H 患者6 2 名，根据超声心动图结果分为E H l 组：单纯高血压组3 l 例( 男1 4 例，女1 7 例) 和E H 2 组：心肌肥厚组3 1 例( 男1 6 例，女1 5 例) ，另选3 0 名健康志愿者作对照组。记录所有受试对象的性别、年龄、身高及体重等
2、一般资料。空腹静脉采血，检测生化指标空腹血糖( F B G ) 、高密度脂蛋白( H D L C ) 、低密度脂蛋白( L D L C ) 、总胆固醇( T C ) 、甘油三酯( 飓) 、尿素氮( B U N ) 、天门冬氨酸转氨酶( A S T ) 、丙氨酸转氨酶( A L T ) 、总胆红素( T B ) 、血钾( k + ) 、血钠( N a + ) ；用酶联免疫法测定血浆A p e l i n 1 2 水平、血管紧张素( A n g l I ) 水平；根据超声心动图及检测结果计算左室质量指数( L V M I ) 及体重指数( B M I ) o 在高血压患者中以A p e l i n
3、 1 2 为应变量，以患者年龄、左心室质量指数、血糖、血脂、A n gl I 含量等指标作为自变量进行多元线性回归统计分析，寻找其相互关系。结果l 心肌肥厚组血浆A p e l i n一1 2 含量低于对照组( P O 0 5 ) ；各高血压组血浆A n g I I 含量( 心肌肥厚组0 3 0 0 1 2 n g m l ，单纯高血压组0 2 8 0 1 3 n g m 1 ) 高于对照组( 0 1 7 O 1 0 n g m 1 ) ( 均为P 1 4 0 m m H g 和D B P ， 9 0 m m I - I g ，或单S B P ， 1 4 0 m m H g ，或单D B P
4、9 0 m m H g 原发性高血压人选对象为新诊断高血压病或既往有高血压病但已停用原有降压药5 个半衰期以上。1 1 2 2 由于既往研究显示A p e l i n 与糖脂代谢紊乱、肥胖、胰岛素抵抗、2 型糖尿病及心力衰竭的发生密切相关，所以本试验排除以下疾病：继发性高血压、糖尿病、高脂血症、冠心病、心房颤动及肺动脉高压、肝肾功能损害及心力衰竭等其他疾病o1 2 仪器设备1 2 1 血压测量采用水银柱式血压计，由鱼跃医疗器械公司生产o1 2 2 超声心动图由专人操作，仪器型号为V i v i d 7 。1 2 3A p e l i n 及A n g 试剂盒由北京康肽生物科技有限公司提供。1
5、2 4 读吸光度O D 值和A p e l i n 水平值由E L I S A 检测仪，仪器型号为：仪器型号：M o l e c u l a rD e v i c e sE m a x1 3 测量方法1 3 1 血压测量方法：被测量者安静休息5 一1 0 分钟，排空膀胱。测量时快速充气，使气囊内压力达到桡动脉搏动消失后再升高3 0 m m H g ，然后以恒定的速率( 2 6 i n t o n e 秒) 缓慢放气，获得舒张压读数后快速放气至零。在放气过程中仔细听取柯氏音，观察柯氏音第一时相( 第一音) 和第五时相( 消失音) 水银柱凸面的垂直高度。收缩压读数取柯氏音第一时相，舒张压读数取柯氏
6、音第五时相。l 一2 分钟后重复测量一次，两次取平均值。如果收缩压或舒张压两次读数相差5 m m H g 以上，应再测量一次，取三次读数的平均值记录o1 3 2 左室质量指数( L e f tV e n t r i c u l a rl l l a S si n d e x ，L V M I ) 测定，患者取平卧位或左侧卧位，由超声科医生专人操作，使用v i v i d7 超声诊断仪，用2 5 M H z 探头进行检查，测量舒张末左室内径( L V D d ) ，舒张末室间隔厚度( S T ) ，舒张末左室后壁厚度( L W ) ，连续测定三个心动周期，取平均值根据D e v e r e u
7、x 公式计算左室质量( L V M ) ，公式L V M ( g )7凼鐾直匿堂医亟主婴窒生堂鱼迨塞f 兰壁塑生2= 0 8 1 0 5 ( L V D D + S T + L V P W ) 3 一L V D D 3 + 0 6 ，L V M I ( s m 2 ) = L V M 体表面积( B A S ) ；B A S ( m s ) = 0 0 0 6 1X 身高( c m ) + O 。0 1 2 8 体重( k g ) - 0 1 5 2 。左室肥厚的诊断标准：左室质量指数男性3 1 2 5 s m 2 ，女陛 1 1 1 S m 21 3 。3 体重指数：B M I ( K S
8、m 2 ) = 体重身高21 3 4 血浆标本的采集和制作1 3 4 1 受试对象空腹l O 小时后取肘静脉血2 m l ，检测血糖、血脂、肝功、肾功、血钾及血钠，用内蒙古医学院附属医院全自动生化分析仪检测，型号为S Y S M A X ，方法为速率法。1 3 4 2 取E D 啦N a2 O g 溶于1 0 0 m l 蒸馏水中，充分搅拌，待完全溶解后，依次取0 4 m l 加入试管中，再将这些试管送入烘箱烘干，备用，( 这样可抗凝3 5 r I l l 全血) 。取抑肽酶一支1 5 0 u ，加入8 m l 蒸馏水中溶解，制成抑肽酶溶液备用o1 3 4 3 采受试者前臂静脉血4 m l 加
9、入有E D T A 的试管中，上下颠倒数次混匀，然后在试管中加入抑肽酶溶液1 0 0 出( 1 8 u ) 。1 3 4 42 小时后，以每分钟1 5 0 0 转的速度离心标本1 5 分钟，取上清液入D u f f o r 管中，标记管D u f f o r 后，放入一7 0 。C 低温冰箱，待检测。1 3 4 5A n g1 T 采用酶联免疫分析法，测定过程严格按照试剂盒说明书要求进行；1 3 4 6A p e l i n 一1 2 测定方法为E L I S A 法。测定过程严格按照试剂盒说明书要求进行，具体如下：1 3 4 7A p e l i n 1 2 酶免试剂盒基于”竞争”的酶免检测
10、原则检测样品A p e l i n 一1 2的水平。A p e l i n 标准品与A p e l i n 一1 2 ( H u m a n ) 、A p e l i n 一1 3 ( H u m a n ) 和A p e l i n 一3 6 ( H u -m a n ) 交叉反应性1 0 0 ，与其他血管活性肽如内皮素1 、缓激肽、C 肽、脑钠尿肽以及心房钠尿肽均无交叉反应，范围0 0 1 1 0 0 n g m 1 1 3 4 8 溶液在水化后一天内使用1 3 5A p e l i n 一1 2 检测试剂盒内容：2 0 化验缓冲浓缩剂；9 6 孔免疫平板( 1 个) ；醋酸盐封闭板( A
11、 P S ) ( 3 个) ；一抗血清( 兔抗体I g G ) ( 1 小瓶) ；，标准肽( 1 u g )生物素酞化肽( 1 小瓶) ；8由鏊直匿堂瞳亟巫塞生堂鱼迨塞! 兰Q 嫂生2过氧化辣根抗生物素蛋白链菌素( 3 0 u 1 ) ( S A r l P a , ) ；基质溶液( 1 2 m 1 ) ；2 NI - I C L ( 1 S m l ) ：1 3 6 检测原理：试剂盒免疫平板预先涂铺有二抗以使非特异性结合位点被阻滞。二抗能结合一抗( 抗体肽) 的F c 片段，一抗的F a b 片段将被标本中的生物素酰化肽或A p e l i n 一1 2 竞争性束缚。生物素酰化肽能和过氧化辣
12、根抗生物素蛋白链菌素相互作用，后者催化四甲基联苯胺( T M B ) 和过氧化氢组成的基质溶液产生一种蓝色液体。酶底物反应被氯化氢( H C L ) 制止，溶液变成黄色。黄色的程度直接与生物素酞化肽和过氧化辣根抗生物素蛋白链菌素混合物的量相关，但与标准溶液或样本中A p e l i n 一1 2 的量呈反相关。这是由于在标准溶液或样本中生物素酰化肽和A p e l i n 1 2 竞争性结合肽抗体( 一抗) 。已知浓度的A p e l i n 1 2 标准曲线相应的被建立，样本中未知浓度的A p e l i n 一1 2 通过外推法由标准曲线决定。1 3 7 酶联免疫法( E L I S A
13、法) 检测血浆标本中A p e l i n 一1 2 水平步骤1 3 7 1 试验之前通读检测议定书；1 3 7 2 用9 5 0 m l 蒸馏水稀释化验缓冲浓缩剂( 5 0 m 1 ) ，这些稀释的缓冲剂；将被用来重组所有其他本试剂盒中的混合物及血浆标本提取物；1 3 7 3 用l m l 缓冲剂再水化标准肽( 1 u g ) ，振荡，这种原液的浓度是1 0 0 0 n g m l ；1 3 7 4 标准肽溶液的准备如下1 3 7 5 用5 m l 缓冲液再水化一抗血清，振荡；1 3 7 6 用5 m l 缓冲液再水化生物素酰化肽，振荡；1 3 7 7 留灿孔作空白对照；，1 3 7 8 加
14、5 u l 缓冲液于B l 孔作为总结合量；9直鏊直匡堂医亟主受塞生堂焦迨塞( 兰塑生21 3 7 9 从稻到释1 各取5 0 u l 己准备好的标准肽溶液加入到C l G l 着五个孔中( 系列稀释液相反的顺序) ；1 3 7 1 0 加5 0 u l 标品入已设计好的孔中；1 3 。7 1 1 加2 5 u l 再水化一抗血清入每一个孔中( 除了空白对照) ；1 3 7 1 2 加2 5 u l 再水化生物素酞化肽人每一个孔中( 除了空白对照) ；1 3 7 1 3 用醋酸盐封闭板( A P S ) 封住免疫平板；1 3 7 1 4 在室温下孵化免疫平板- d , 时；1 3 7 1 5
15、离心试剂盒中提供的过氧化辣根抗生物素蛋白链菌素( 3 0 u 1 ) ( S A H R p )( 5 0 0 一10 0 0 r P m ，1 5 秒) ；然后移液1 2 u lS A H R P 人1 2 m l 缓冲液中制成S A H R P 溶液，振荡；1 3 7 1 6 从免疫平6 L t ：移走醋酸盐封闭板( A P S ) ；1 3 7 1 7 丢弃孔中的内容物；1 3 7 1 8 用3 0 0 u l 缓冲液洗每一个孔( 除了空白对照) ，丢弃缓冲液吸干平板，重复5 次；1 3 7 1 9 加1 0 0 u l 过氧化辣根抗生物素蛋白链菌素入每一个孔中( 除了空白对照) ；1 3 7 2 0 用醋酸盐封闭板( A P S ) 再次封住免疫平板；1 3 7 2 l 在室温下孵化免疫平板一小时；1 3 7 2 2 向上述描述的用缓冲液洗并吸干免疫平板六次；1 3 7 2 3 加试剂盒中提供的基质溶液1 0 0 u l 入每一个孔中( 包空白对照) ；1 3 7 2 4 用醋酸盐封闭板( A P S ) 再次封住免疫平板；1 3 8 2 5 在室温下孵化免疫平板一小时；1 3 7 2 6 加1 0 0 u 1 2 NH C L 入每一个孔中( 包空白对照) 以停止反应，在2 0 分钟内进人下一步骤；1 3 7 2 7 用7 0
