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1、PI 染色检测细胞周期染色检测细胞周期 protocol1、离心收集细胞，弃上清，用预冷 PBS 洗细胞两次。2、加入预冷 70%乙醇，于 4固定过夜，或-20长期固定（4过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20，有资料说-20可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。3、细胞染色离心收集细胞，以 1mL 的 PBS 洗细胞一次，加入 500uLPBS（含 50ug/mL 溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Tr
2、iton X-100）4避光孵育 30 分钟（PI 我是直接用 PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA 酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。4、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数 2-3 万个细胞，结果用细胞周期拟和软件 ModFit 分析。分析时，使用 FL2-w 和 FL2-A 显示，去除联体细胞，具体如下图。细胞周期流式后一般分为 G0/G1,S,G2/M 期三部份，如果有凋亡，在 G0/G1 期前面有个凋亡峰(也称 sub-G0 期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。结果解读G0/G1 期细胞占总的 61.2%，峰位于横座标的
3、 45.76G2/M 期占 13.07，峰位于横座标的 91.43S 期占 25.73G2/G1 为 2.0（即 G2 期为 4 倍体细胞，而 G1 期为 2 倍体细胞，比值为 2）峰的变异系数为 4.54%（好）细胞碎片为 0.48%，细胞聚集体有 0.06%。总的细胞数（仪器检测到的）为 17525 个，在细胞周期中分析的细胞数为 17431 个（即排除了碎片及聚集体后）CV 是变异系数。一般 CV 越小，峰形越好，越尖锐。能控制在 5%左右是比较好的结果，一般小于 10%就可以认可了。Flow Cytometric Analysis of Cell CycleFixation1) Col
4、lect 2106 cells.2) Pellet cells by spinning at 1,000 rpm, 4C for 5 minutes.3) Resuspend cell pellet in 1 ml of cold PBS.4) Fix cells by adding 4 ml of -20C absolute ethanol.5) Store cells at -20C in this fixation buffer until ready for analysis. (No more than 2 weeks)Staining6) Centrifuge (as above)
5、 fixed cells and resuspend pellet in 1 ml of PBS.7) Add 100 l of 200 g/ml DNase-free, RNaseA and incubate at 37C for 30 minutes. 8) Add 100 l of 1 mg/ml propidium iodide (light sensitive) and incubate at room temperature for 5-10 minutes.9) Place samples in 12 X 75 Falcon tubes and read on Becton Di
6、ckinson FACStarPLUS.PI 染液配制（100ml）：PI 5mg、RNase 2mg、1.0%Triton X-100 0.25ml、生理盐水 65ml、枸橼酸纳 100mg，加蒸馏水至 100ml，调 pH 值 7.2-7.6，用棕色瓶子分装，4避光 保存。 注意事项：1 在细胞固定时一定要将细胞吹开，吹成单细胞；2 固定液：70%酒精 要在-20 预冷；3 细胞要选用活力高的。流式细胞流式细胞 PIPI 单染中为什么用单染中为什么用 RNAseRNAse？在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI 很容易透过细胞膜和 DNA 结合，但RNA 也是核酸，也会被染色，为避免
7、干扰染色前需用 RNAse 降解 RNA。这样 PI 只染 DNA，能精确以荧光强度反映 DNA 的含量。做流式细胞时，做流式细胞时，PIPI 染色，染色，PIPI 的浓度应该是多少的浓度应该是多少? ?还有就是还有就是 400400 目的筛网是什么？目的筛网是什么？100ug/ml，一般用 400 目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的，否则会出现人为的多倍体干扰，分析的时候需要的是单个的细胞，不过如果经验丰富也 可以 gate 掉的。如果你没有条件，建议在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色PI 的配置的配置deardeer：PI 怎样配制？怎样保存？有的文献说要用柠檬酸钠溶解，这对实验有影响吗？如果不这样，那直接加入而不用柠檬酸钠溶解可以吗？andywang：我用来做流式的 PI 配制方法是: 5mg PI +0.1ml Triton X-100 +3.7mg EDTA +10ml PBS,4 度避光保存。为储存液，用时稀释 10 倍。
