神经性有机磷毒剂及农药的荧光光纤生物传感器的研制博士后杨欣合作导师阮金秀研究员 谢剑炜副研究员流动站( 一级学科) ：药学 专业( 二级学科) ：药物分析学研究工作起止时间：2 0 0 0 ．8 ～2 0 0 2 ．8军事医学科学院2 0 0 2 年8 月神经性有机磷毒剂及农药的荧光光纤 生物传感器的研制( 摘要)本研究报告第一部分研究工作是合成了含乙烯基团的丙烯酰胺基荧光素作为载体，然后在经3 一( 三甲氧基硅基) 甲基丙烯酸丙酯( T s P M ) 硅烷化引入乙烯基团的普通玻璃片上与膜基体单体甲基丙烯酸B 一羟乙酯，光引发剂安息香乙醚共存，紫外光照射光聚合制备成光极膜，并与乙酰胆碱酯酶固相酶片复合，研制出了用于测定有机磷农药敌敌畏( D D V P ) 、对氧磷( P a r a o x o n ) 、对硫磷( P a r a t h i o n ) 、甲基对硫磷( №t h y 卜P a r a t h i o n ) 和神经陛毒剂沙林( S a r i n ) 、梭曼( S 锄) 、V X 、6 1 3 、G F等的通用型荧光光纤一酶复合生物传感器，对影响荧光强度( 或酶活性) 的各种实验因素，如p H 值、底物种类与浓度等进行了优化，结果表明在p H 为8 ．O 的磷酸缓冲溶液中，乙酰胆碱酯酶固相酶片与底物溴代乙酰胆碱的反应最佳，此传感器除对P ”a t h i o n 、M e t h y 卜P a r a t h i o n 无响应外，叻V P 、P a r a o x o n ( 1 旷L 1 0 ’‰o lL 。
) ，s o f I l a n 、s a r i n 、V x 、6 1 3 、G F ( 1 旷1 屯1 0 —4 舯lL - 1 ) ，均与溶液荧光强度( 即酶的活性) 有一定的相关关系，响应时间小于3 0m i n ，尤其是该传感器具有在检测s o I n a n后乙酰胆碱酯酶可通过氯磷定( 2 一P A M - c 1 ) 重活化再生的特点，显示出良好的可逆性、重现性( R S D s - < 蒜一荭》 tS u r 嘲c es { 1 a n i 7 a ：l ：i n nF i g u r e2 —5S c h e m 疵i l l u 咖t i o no f m e ”p a 糟d o no f m em e m b r a I l e —m o d i f i e dc o n 、，e n t i o n a lg l a s sd i s c1 ．4 ．4 测量方法在最大激发波长4 8 0n I I l 和发射波长5 2 2 n m 处测量荧光强度，将光极膜与固定于尼龙网上的乙酰胆碱酯酶片装入流通池中，恒流泵以1 ．5 血m 酊1 的速度将样品和作为底物的溴代乙酰胆碱溶液输入流通池，记录膜与样品溶液达到平衡时的荧光强度，每次测量后均通过空白缓冲溶液或重活化剂氯磷啶溶液以使光极膜荧光和乙酰胆碱酯酶的活性恢复至初始值，以备下次测量使用。
叭．昱? ：丫J2 结果与讨论2 ．1 光极膜的响应特征图2 - 6 表明了共价键合丙烯酰胺基荧光素的光极膜与空白水溶液接触的荧光发射光谱为了消除散射光的干扰，实验中检测波长选择荧光激发波长为4 8 0 m ．发射波长为5 2 2 n m 有机磷化合物对酶的催化反应有着明显的抑制作用，随着有机磷化合物溶液浓度的增大，由其引起的抑制作用导致光极膜荧光强度的降低F i g I 】r e2 —6n en u o r e s c e n c ee 血s s ms p e 咖o f 位o p t o d em e m b m ee x p o s e d t o w a t e r b h _ 1 k2 ．2 底物的选择乙酰胆碱酯酶可以催化不同取代基的胆碱类化合物，且催化反应完全与否取决于酶活力的大小实验中采用溴代乙酰胆碱和碘化硫代乙酰胆碱作为反应底4 1茸∞口Ⅱ萋}写『I蛊物当溴代乙酰胆碱作为反应底物时，随着溶液p H 值的增加，荧光强度不断增加，至p H 值为8 ．O 一8 ．5 时，出现稳定的平台区，而以碘化硫代乙酰胆碱作为反应底物时，随着溶液p H 值的增加，荧光强度呈现上升趋势，至p H 为8 ．O 时，达到一个最高值，随后不断下降，如图2 —7 所示。
实验中选择了溴代乙酰胆碱作为酶促反应的底物口HF i g u r e2 —7p Hd e p e n d e n c eo f t l l eo p 惦d ee x p o s i n gt oa c e 哆l c h 0 1 i n eb r o 】曲d e ①卜A c h ) ( 口) a n da c e 蛳c h o l i n ei o d i d e ( △)2 ．3p H 值的影晌溶液酸碱度的大小，直接影响到乙酰胆碱酯酶的活性，加之共价固定于玻璃片上的荧光化合物丙烯酰胺基荧光素是一个较灵敏的p H 指示剂，实验考察了溶液p H 对此酶促反应的影响当仅有固定的丙烯酰胺基荧光素玻璃片与不同p H值溶液接触时，随着溶液p H 值的增加，荧光强度呈现一定的上升趋势，至p H 值窘∞量日u}蔓∞醋为8 ．O 时，荧光强度出现最大值，继续增加溶液的p H ，荧光强度略有一些下降而当有乙酰胆碱酯酶片存在时，随着溶液p H 值的增加，荧光强度同样呈现一定的上升趋势，至p H 值为8 ．5 时，荧光强度出现最大值，如图2 —8 所示结合反应底物的影响，实验选择了p H 为8 ．O 的磷酸缓冲溶液作为最佳p H 值。
F i g u r e2 —8p Hd 印e n d e n c eo f t l l eo p c o d ee x p o s i n gt o 稍仕l o u t ( 口)趾d 埘血( △) a c 嘶l c h o l 砘咖r a s e ( A C h E )2 ．4 反应底物浓度的影响为了使酶的活力达到最大，反应底物的浓度大小就显得非常重要在选择以溴代乙酰胆碱为底物时，对其浓度进行了考察随着溴代乙酰胆碱浓度的增加，光极膜的荧光强度逐渐趋于稳定，实验选择了2I l ⅡI 1 0 1L _ 1 的溴代乙酰胆碱溶液作为底物浓度( 图2 —9 ) 奇Is重S}薯一盘C B r - A C hF i g l 】r e2 —91 1 l ee 船c to f a c 啷，1 c h o l i n eb r o I n i d e ( B r _ A C h ) c o n c e n t r a 矗o n2 ．5 光极膜的响应时间、可逆性和重现性传感器光极膜与2 哪o lL 1B r —A c H 、1 ．0 ×1 0 1m o lL 『1 对氧磷( P a r a o x o n ) ( 图2 —1 0 ) 或1 ．O ×1 0 ‘1 0 m o lL “沙林( 图2 —1 1 ) ，或1 _ O ×1 0 “m 0 1L 1 梭曼( 图2 一1 2 ) 和lI l Ⅱ1 1 0 1L - I 氯磷啶( 2 一P A M —C 1 ) 交替接触时，荧光强度与时间的响应曲线如图所示。
光极膜与样品溶液接触时，达到平衡的响应时间短，小于3 0 m i n ，而使用2 一P A M _ c l对被对氧磷抑制的酶进行重活化时，荧光强度恢复至初始强度所需时间也快，没有观察到明显的滞后效应，尤其是对氧磷响应时间小于l o m i n ，重活化时间仅为5 m i n ，交替使用样品溶液和重活化剂时表现了良好的可逆性，同时对对氧磷、沙林样品溶液6 次平行测定结果的相对标准偏差分别为3 ．1 5 ％和2 ．4 8 ％，表明光极膜具有良好的重现性对于梭曼样品溶液浓度从1 ．O ×1 旷“～1 ．O ×1 0 1m 0 1L _ 【，交替地与氯磷啶溶液接触后，荧光强度与时间的响应曲线充分体现了此传感器所具有的良好的可逆性和重现性茸目当￡He一∞岛F i g u r e2 ·1 0T h e 血1 ed e 职n d e n tr c 平o n s eo f 吐l es e r l s o ro p 幻d e ．1 1 1 es e n s o rm e n n ) m n ei sa 1 把m a t i v e l ye x p o s c dt o1 ．O ×1 0 4r n o lL ．1p a r a o x o nm 波e dw №2m m o lL - 1B r - A c h ( a ) a n d1n u n o lL _ 1p r a l i d o x i m em e t l l y l c h l o r i d e ( 2 一P A M —C 1 ) @2 ．6 反应机理的探讨当样品溶液沙林和V X 与光极膜接触时，乙酰胆碱酯酶被抑制，氯磷啶对于沙林和V ×抑制的乙酰胆碱酯酶的重活化率，即传感器的可逆性、重现性较好。
而本实验结果证实了梭曼也同样具有这一特性，此反应机理可初步理解为固定于尼龙网上乙酰胆碱酯酶的构象不同于溶液中的乙酰胆碱酯酶，并在与s o m a n 结合的位点上存在差异，从而可被2 一P A 卅c 1 重活化，也与实验环境条件有一定的关系对于此反应机理的合理解释则需要进一步的实验来论证^=目Q_Ⅱ!；案百高F i g u r c2 _ 1 11 h e 血n ed 印e n d e n tr e s p o n s eo f 廿l es e r l s o ro p t o d e ．1 1 1 es e n s o rm e m b r a n ei s 池m 撕v e l ye x p o s e dt o1 ．0 ×1 0 邶m o lL ．1s a 咖r n i x e d 谢t l l2 蚴o lL ．1B H 蛐( a ) a 王l d1m m 0 1L ．1p r a j i d o X i m em e m y l c M 谢d e ( 2 P A M ．C 1 ) ( b )2 ．7 光极膜短期的稳定性为了监测荧光染料丙烯酰胺基荧光素从光极膜上的流失情况，以及乙酰胆碱酯酶活力维持时间长短，将光极膜、乙酰胆碱酯酶片与样品溶液接触，连续使用一个月后，光极膜的荧光强度仍可恢复至初始值，表明此传感器具有较好的稳定性。
F i g u r e2 一1 2R e s 】) o n s ec u r V e sf o rn o 、v i n gs y s l m 、v i t hf c ds a 瑚【p l e so fd i 丘b r e n ts o m a n s o h m o n c o n o 啪扛嘶o n ，a ．p H8 ．0 p h o s l ) h a t e b u 位r s o l 嘶o n + B r - A c h ；b ．1 ．O ×1 0 ‘1 2c ．1 ．0 ×lo - J 1 ；d ．1 ．O x l0 ．1 0 ；e ．1 ．O ×1 0 ‘9 ；￡1 ．O ×1 0 4 ；g ．1 ．O ×1 0 7 ；h ．1 ．O ×1 0 4 ；¨．O ×1 0 4 ；j ．1 ．o ×1 0 4m o lL - l ；k ．1 n l n l o lL - 12 一P A M —C ls o l 砸o n2 ．8 光极膜的选择性任何物质通过渗透进入光极膜中，猝灭光极膜的荧光强度或与分析物发生反应都会干扰分析测定假若以共存物质存在时光极膜的荧光强度变化的相对误差小于或等于±5 ％视为不干扰的话，对于5 ．o ×1 0 。
7m o lL ．1V X 或梭曼溶液样品的测定，实验考察了水中常见离子如K + 、N a + 、c a 2 + 、M 矿、P 旷、F e “、F e 3 十、办”、M n 2 + 、c ，、c ，、N O i 、s 0 4 2 ．、c r 及酚类( 苯酚、对硝基酚、2 ，4 一二硝基酚)对光极膜荧光强度的影响，结果表明在大于安全饮水浓度若干倍的干扰物存在时，光极膜具。