《四、定量NestedRTPCR方法检测大肠癌及大肠良性疾病CEAmRNA的应用研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《四、定量NestedRTPCR方法检测大肠癌及大肠良性疾病CEAmRNA的应用研究（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、8 4 第二篇科研论文 6 J a r v i n e nH I ，A a r n i oM ，M u s t o n e nH ，e ta I C o nt r o l l e d1 5 - y e a rt r i a lo ns c r e e n i n gf o re o l o r e c t a lc a n c e ri nf a m i l i e sw i t hh e r e d i t a r yn o n p o l y p o s i sc o l o r e c t a lc a n c e r J G a s t r o e n t e r o l o g y
2、，2 0 0 0 ，1 1 8 ( 5 ) ：8 2 9 8 3 4E 7 3R a b e l oR ，F o u l k e sW ，G o r d o nP H ，e ta LR 0 1 eo fm o l e c u l a rd i a g n o s l i ct e s ti nF a m i l i a iA d e n o m a t o u sP o l y p o s i sa n dH e r e d i t a r yN o n p o l y p o s i sC o l o r e c t a lC a n c e r f a m i l i e s J D i
3、s C o l o n R e c t u m ，2 0 0 1 ，4 4 ( 3 ) ：4 3 7 4 4 6 四、定量N e s t e d R T P C R 方法检测大肠癌及 大肠良性疾病C E A m R N A 的应用研究郝立强孟荣贵张卫傅传刚戴建新第二军医大学长海医院( 2 0 0 4 3 3 )关键词：大肠癌；癌胚抗原信使核糖核酸；定量癌胚抗原( C a r c i n o e m b r y o n i eA n t i g e n ，C E A ) 自1 9 6 5 年应用于临床以来已作为胃肠道肿瘤的诊断和判断预后的监测指标口 。C E A 的检测方法较多，但常用的有放射免
4、疫法( 包括间接法、直接法) 、固体相放免法和酶免疫法。C E A 的表达在所有肿瘤中大肠癌是最高的，但用上述检查方法，大肠癌患者血清C E A 的阳性率D u k e sA 、B 期仅为3 6 ，D u k e sC 、D 期也只有7 4 2 ，无论血清放免、固相免疫、酶免疫还是单克隆抗体放射显影法都远较R T P C R 方法检测血中C E A m R N A 的敏感性低，故该方法越来越受到人 们的重视。我们用定量R T P C R 的方法检测2 5例手术切除的大肠肿瘤、肠系膜淋巴结及2 2 例大肠良性病变和6 例健康人外周血中的C E A m RN A ，并对术前和术后进行比较，根据定量
5、的变化来探讨C E A m R N A 在体内表达的不同，以此判定肿瘤的恶性程度，治疗效果和预后。1 材料和方法1 1 材料1 1 1 随机选取我科1 9 9 8 1 9 9 9 年大肠癌患者共2 5 例手术切除的肿瘤及肠系膜淋巴结组织标本。其中，男1 4 例，女1 l 例。年龄3 3 7 9 岁，平均5 8 4 岁。低分化腺癌9 例，中分化腺癌1 0 例，高分化腺癌6 例。其中D u k e sA 期1 例，D u k e sB 期9 例，D u k e s C 期9 例，D u k e s D 期6 例。并且对淋巴结病理阴性患者随访2 0 个月。1 1 2 选取我科1 9 9 9 年至2
6、0 0 1 年家族性结肠息肉病7 例，其中男4 例，女3 例。年龄2 l 3 6岁，平均3 1 2 岁。溃疡性结肠炎5 例，其中男2例，女3 例。年龄3 6 4 9 ，平均4 2 岁。大肠多发息肉1 0 例，其中男6 例，女4 例。年龄2 8 5 6 岁，平均4 5 3 岁。提取病变组织及外周血标本。作为对照抽取6 例正常健康人外周血5m l 检测。1 1 - 3 血液细胞总R N A 提取试剂盒和T a q 酶、限制性内切酶、缓冲液、d N T P 、镁离子等( 均为华美公司产品及T a K a R a 宝生物工程公司产品) 。1 2 方法1 2 1 标本总R N A 的提取：分别提取每个样
7、本的总R N A ( 方法见R N A 提取试剂盒说明书) 并取1 0 p l 于6 5 0 C 水浴1 0 m i n ，冰浴2 m i n ，以5 ：l 的比率加入2p l 溴酚蓝，在1 E B 凝胶电泳。剩余R N A 储存于- - 7 0 。C ，作R T P C R 反应模板。1 2 2设计引物：引物A ：5 T c T G G A A C T ，r C l l 了G T C r ( 卫A ( X j x ；一3 ；引物B ：5 ，一T G T A G C T G T T G C C A A A T G C T T T A A G G A A G A A G C 一3 ；引物C ：5
8、 | G G G C C A C TG T C G G C A T C A T G A T T G G 一3 ( 引物由生物工程公司合成) 。按设计要求首轮P C R 产物为1 6 0b p ，两轮P C R 产物为1 3 0b p 。1 2 3内参照竞争模板的设计合成：按C E Ac D N A 序列距上游引物( 引物A ) 1 l ob p 的位置上引入P s t I 酶切位点，也就是将T T I C A G 突变成 C r G C A G ，这样两轮P C R 的产物1 3 0b p 中位于8 0b p ( 距引物A ) 位置就有P s t I 酶切位点。产物酶切 后产生8 0 及5 0
9、b p 的两条条带，与标本的P C R 产四、定量N E s t e d R TP c R 方法检测大肠癌及大肠良眭疾病L E A m R N A 的应用研究8 5 物1 3 0b p 可区分( 因无P s t I 酶切位点故不能被酶切) 。该模板由生工公司合成并体外转录成R N A 。L2 4 系列稀释内参照竞争模板：将标本孙蛆与每种稀释度的内参照竞争模板于同体系中进行反应。1 2 5反转录P C R 体系及反应：总体系为2 0 p 1 ，包括2 5 U 反转录酶、终浓度为1 5 m m o l LM g C 2 、1 2 5b m o I Ld N T P 、2p l 标本R N A 、2
10、p i内参照竞争模板lp m o l L 引物A 、lp m o l I 。引 物c 、1 0 P C R 缓冲液、2 5 U T a q 酶及D E P C 处理的双蒸水。反应条件：3 7 反转录9 0r a i n ，9 4 变性5m i n 。9 4 变性1m i n ，6 7 退火4 5s ，7 2 延伸3 0s ，共3 5 个循环，最后7 2 延伸5m i n 。取2p l 反应产物加入第二轮反应体系1 2 5u m o l Ld N T P 、1 5m r m l l 。M g C l 2 、1 2 r n o l L 引物B 和1v m o l L 引物C 、2 5 U T a
11、q 酶、1 0 X P C R缓冲液及I ) 处理的双蒸水。反应条件同上一轮。1 2 5P C R 循环数的确定由于P C R 扩增是一指数倍增过程，确定P C R 反应达到平台期前的合适循环数，将第一轮反应定为1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 0 个c y c l e s 第一轮每种循环产物，分别行第二轮四种循环数反应，产物电泳对比条带浓度，确定循环数为2 0 个( 见图1 ) 。标本D N A 片段内竞争模板片段1内竞争模板片段2囤1 循环数的电泳带1 0 01 0 11 0 21 0 31 0 4图2 大肠癌患者外周血C E A m R N A1 2 7P C R 产物酶切：总体系2 0
12、p 1 ，包括P C R产物1 0p 1 、酶切缓冲液2p l 、P s t I 内切酶1p 1 和7 p l 双蒸水，于3 7 反应1 5h 。1 2 8 电泳分析及定量：将各稀释度P C R 酶切反应产物在8 的聚丙烯酰胺凝胶上电压为1 8 0 2 0 0V 进行电泳。然后将凝胶切下于E B 液中染色1h ，采用H PV e c t r aP C ( 8 0 2 8 6 ) 图像处理系统对电泳条带进行光密度扫描，求出条带平均光密度和面积，两者乘积代表对应D N A 含量。将标本条带D N A 含量与内竞争模板两条酶切子带D N A 含量之和进行对照，测算大肠癌患者外 周血C E A m R
13、 N A 的水平( 见图2 ) 。1 2 9 统计分析：收集结果，数据采用1 0 及中位数表示。两组间比较采用S t u d e n tt 检验，小样本资料采用F i s h e r 确切概率计算，多个样本均数间的两两比较采用方差分析，所用数据均由计算8 6 第二篇科研论文机S P S S 软件进行统计学处理，得出结论。2 结果2 12 5 例肿瘤标本的病理检测结果 用定量N e s t e dR T P C R 方法检测C E A m R N A 均呈阳性，表达量亦大。C o p y 数为l o ”9 ，中位数为1 0 7 。2 5 例淋巴结中病理报肿瘤转移者1 l 例( 4 4 ) ，该1
14、 1 例用N e s t e dR TP C R 方法检测C E A m R N A 均呈阳性且量多，C o p y 数为1 0 6 一，中位数为1 0 7 ；而1 4 例( 5 6 ) 病理报肿瘤阴性者用N e s t e d R T P C R 方法检测 C E A m R N A 有5 倒( 3 5 7 ) 阳性，C o p y 数为1 0 2 ，中位数为1 0 2 。1 6 例阳性淋巴结C E A m R N A 的表达量见表l ，对1 4 例淋巴结病理报肿瘤表1阴性者进行随访，结果：N e s t e dR TP C R 检测C E A m R N A 阳性的5 例患者均在2 0 个
15、月内复发，而C E A m R N A 阴性者均未复发。这也证明了N e s t e d R T P C R 检测方法的敏感和准确性。在淋巴结检测中，N e s t e d R T P C R 方法检测 c E A m R N A 的方法在2 5 例淋巴结中检测到1 6 例肿瘤转移。也就是说淋巴结转移的检出率为1 0 0 ；而传统病理检出率仅为6 8 ( 1 1 1 6 ) 。N e s t e d R T P C R 检测方法明显比常规病理检查敏感而准确( P o 5 ) 。结果见表2 。2 5 例手术标本检测结果病例篆嚣D u k e s分期病理类型( 腺癌)C E 融A m R N A
16、舢C E 粕A m R 结N A 鬟I N ( c o p y ( c o p y 数g g R N A )访二二访效p g R N A )。一1男6 2C中分化1 0 72男5 6B高分化1 0 53女7 0B中分化1 0 64男4 8C低分化1 0 85女6 8D低分化1 0 76男3 6D中分化1 0 87男3 3c高分化1 0 98女4 3B中分化1 0 59女7 5B中分化1 0 71 0女6 1A高分化1 0 51 l男7 7C低分化1 0 71 2男4 6D中分化1 0 81 3男4 8D低分化1 0 91 4男4 0C高分化1 0 815女6 9B高分化1 0 61 6男6 3B中分化1 0 61 7男7 9c低分化1 0 61 8女6 4D中分化1 0 91 9男4 5C低分化1 0 72
