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1、盂宪民基金会首届学术讨论会暨第十二届全国普外基础与I 临床进展学术大会普外进展论坛响。对象及方法进展期胃癌；术中肉眼无转移或局限腹膜转移而完整切除；术前无放、化疗史；未失访者。本组符合上述条件的患者共有2 1 2 例，将其随机分成两组，治疗组( 术中腹腔温热灌注化疗+ 术后外周静脉化疗) ：9 2 例，其中男5 1 例，女4 1 例，年龄2 1 8 7 岁，平均5 6 8 岁。对照组( 单纯术后外周静脉化疗) ：1 2 0 铡，其中男8 4 例，女3 6 例，年龄2 0 8 2 岁，平均5 7 4 岁。两组的病变部位、手术方式、组织类型及T N M 分期等具有可比性。方法腹腔游离癌细胞的检测：
2、两组所有病例开腹后均证实有不同程度浆膜浸润，在肿瘤切除前后分别收集腹腔液并进行离心、沉淀后在光镜下查找癌细胞。术中腹腔内温热灌注化疗：胃癌根治性切除手术完成后、关腹之前，治疗组( 即腹腔内温热灌注化疗) 将化疗药物( 丝裂霉素3 0 m g 、顺铂1 0 0 m g ) 溶于蒸馏水2 0 0 0 m l 一3 0 0 0 m l 中，加温至4 3 4 5 。C后灌人腹腔保留3 0 分钟后吸尽。对照组仅用生理盐水2 0 0 0 m l 常规冲洗。术后外周静脉化疗：两组术后7 一1 5 天均常规进行外周静脉化疗，方案5 F U + M M C + A D M ，剂量为5 F U l 0 。1 5
3、m g 瓜g - 1 、M M C 0 1 一O 1 5 m g k g - 1 、A D M 00 5 一l m g k g 一1 ，每周1 次，2 或3 次为一疗程，休息4 周后行下一疗程，总共6 个疗程。结果治疗组与对照组术后2 年内腹腔种植转移复发率分别为1 4 1 和3 7 5 ( P 0 0 1 ) 。治疗组术后1 ，3 和5 年生存率分别为9 8 9 、6 8 5 和5 2 2 ，对照组为9 5 O 、5 6 7 和3 7 5 ，两组3 ，5 年生存率差异显著( P 0 0 5 ) 。结论术中温热灌注化疗具有杀灭腹腔游离癌细胞的作用，对进展期胃癌根治术后腹腔种植转移复发有较好的防
4、治作用，能明显提高患者术后生存率。L 。精氨酸预处理对大鼠小肠移植缺血再灌注损伤的影响口南京医科大学第一附属医院普外科曹斌口，南京军区南京总医院全军普外研究所李宁黎介寿小肠移植是治疗短肠综合征的根本方法。尽管近年来小肠移植的成功率有了较大提高，但缺血再灌注损伤、排斥反应和感染等仍是影响小肠移植结果的主要因素。反复多次的短暂缺血可以使机体耐受随后较长时间的缺血，这一现象被称为缺血预处一1 9 3 孟宪民基金会首届学术讨论会暨第十二届全国普外基础与临床进展学术大会普外进展论坛理。缺血预处理现象在小肠也得到证实，实验发现伴随着小肠缺血预处理有一氧化氮( N O )合成，而如果给予N O 合成抑制剂L
5、 - N A M E ，则可以部分消除缺血预处理的效应，说明缺血预处理可能通过内源性物质( 如N O 等) 发挥作用。进一步的研究发现缺血预处理对小肠移植中移植肠冷缺血再灌注损伤也有保护作用。L 精氨酸是体内N O 的底物。研究发现L 广精氨酸可以改善移植肠形态、粘膜结构和粘膜屏障功能。另有研究发现通过静脉持续输注L 精氨酸促进N O 合成可以减轻小肠缺血再灌注损伤。上述多数实验研究中L 广精氨酸均是应用于受体，由于L 精氨酸对机体免疫功能具有多重影响，因此在移植术后受体应用L 精氨酸可能会干扰抗排斥治疗。因此，本实验主要研究供体L 精氨酸预处理对移植肠缺血再灌注损伤的保护作用。材料和方法1
6、实验动物：供、受体均采用雄性近交系W i s t a r 大鼠，体重在1 8 0 2 5 0 9 之间( 购自中科院上海实验动物中心) 。实验前动物饲养于南京金陵医院实验动物中心，适应环境一周。实验时按体重相近的原则配对。2 动物模型与实验分组：小肠移植参照李元新和伍晓仃等的方法。采用异位全小肠移植模型。带肠系膜上动脉和门静脉的供肠采用R i n g e r S 液4 “C 保存8 小时后行小肠移植。供肠肠系膜上动脉与受体腹主动脉吻合，供肠门静脉与受体左肾静脉吻合。动物随机分成4 组：第一组( 5 分钟预处理组，n = 1 2 ) 移植肠获取前5 分钟给供体静脉注射精氨酸( 5 0 m g k
7、 g ，l m l ) ；第二组( 9 0 分钟预处理组，n = 1 2 ) 移植肠获取前9 0 分钟给供体静脉注射精氨酸( 5 0 m e f 2 9 ，1 J n l ) ；第三组( 对照组，n = 1 2 ) 移植肠获取前9 0 分钟给供体静脉注射1m l 生理盐水；第四组( 假手术组，n = 6 ) 动物剖腹后探查小肠。但不行其他手术处理，以排除外科手术对实验的影响。3 检测指标：组织中M D A 和M P O 含量M D A 测定采用苯巴比妥酸法。M P O 的测定参照K r a w i s z 的方法，将组织匀浆后取上清，测定其还原H 2 0 2 后在4 6 0n r l l 处吸
8、光度的变化，计算出组织中M P O 的含量。移植肠病理改变盂宪民基金会首届学术讨论会暨第十二届全国普外基础与临床进展学术大会普外进展论坛再灌注1 5 分钟的移植肠标本用1 0 福尔马林固定后切片，行伊红一苏木素染色。运用P a r k s - C h i u 评分标准对缺血再灌注造成的病理学改变进行评分。所有病理切片分析均采用双盲法以排除偏差。移植肠上皮细胞凋亡采用脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法( T U N E L ) ，细胞凋亡试剂盒购自罗氏公司染色步骤按细胞凋亡试剂盒说明书进行，碱性磷酸酶标记。显微镜下观察凋亡细胞的分布，细胞核被染成蓝紫色为阳性细胞。每张切片在4 0 0 倍视野下
9、随机选取5 个阳性视野，以凋亡指数( 阳性细胞数小肠黏膜上皮细胞总数) 反映凋亡程度。移植肠两周存活率移植术后每日观察动物的健康状况，记录每组移植肠的两周存活率。4 统计分析结果以均数崭暴准差表示。采用S P S S 软件分析，用独立样本t 检验和非参数x2 检验，以P = 0 0 5 为差异显著。结果：1 M D A 和M p o假手术组小肠M D A 和M P O 含量分别为2 o 0 2 2m m o l g 和0 6 6 - 0 1 0 5U g 。8 小时冷保存和1 5 分钟再灌注后移植肠组织M D A 和M P O 含量明显上升，供肠术前9 0 分钟L - 精氨酸预处理明显减轻了M
10、 D A 和M P O 的上升幅度，但是如果将L 精氨酸给药时间由术前9 0 分钟缩短至术前5 分钟，则对M D A 和M P O 水平没有明显影响，( 表1 ) 。表1 各组小肠组织M D A ( m m o v g ) 和M P O ( U g ) 含量8 P 0 0 5 “ 9 8 空白对照。P 0 0 5w 对照组a 与假手术组相比t - - - 4 2 1 8 P = O 0 0 21 9 5 孟宪民基金会首届学术讨论会暨第十二届全国普外基础与临床进展学术大会普外进展论坛b 与对照组相比t = - 1 0 9 1P = 0 3 0 1c 与对照组相比t = 2 2 2 8P = 0
11、0 5d 与假手术组相比t = 1 7 0 4P = 0 0 0 0e 与对照组相比t - 一1 3 7 5P = 0 1 9 9f 与对照组相比t 一1 0 5 3 6P = 0 0 0 12 移植肠形态学变化：缺血再灌注引起移植肠发生明显的形态学改变，表现为小肠绒毛形态异常( 缩短、水肿增粗、断裂等) 、黏膜固有层充血、水肿、出血等。而供肠术前9 0 m i nL 精氨酸预处理则明显减轻了上述病理学改变，( 表2 、图1 略) o表2 各组移植肠病理学评分结果g 与对照组相比t - - - 0 5 4P = o 5 9 9 0 3 6 1 7 0 3h 与对照组相比t - - - 5 3
12、9P = 0 0 0 11 5 6 5 。3 7 6 83 移植肠上皮细胞凋亡缺血再灌注导致移植肠上皮细胞凋亡，供肠术前5 分钟给予L 精氨酸未能减轻细胞凋亡，但当给药时间提前到术前9 0 分钟时移植肠上皮细胞凋亡得到明显减轻，( 表3 、图2 略) 0表3 移植肠上皮细胞凋亡( 5 0 0 个上皮细胞)组别凋亡细胞数假手术组对照组5 分钟预处理组9 0 分钟预处理组j 与假手术组相比t - - - 6 1 2 5 ，P = 0 0 0 1 ；k 与对照组相比t = O 5 1 1 ，p = 0 6 2 0 ；1 与对照组相比t - - - 4 2 0 0 ，P = O 0 0 2 ；m 与5
13、 m i n 预处理组相比t = 2 2 5 3 ，P = 0 0 4 8 。4 移植肠两周存活率：术后两周移植肠存活率如表三所示。8 小时的冷保存和1 5 分钟再灌泞所造成的缺血再灌1 9 6 一豢5控限_ 三盂宪民基金会首届学术讨论会暨第十二届全国普外基础与临床进展学术大会普外进展论坛注损伤使对照组所有移植肠在术后两周内全部失活，表现为肠管节段性暗红，随后肠黏膜大片坏死脱落，大量稀薄肠液分泌，移植肠失去弹性和张力，动物一般在随后的1 - 2 天内死亡。该组移植肠最长存活时间仅3 6 小时。供体术前9 0 分钟L - 精氨酸预处理明显减轻了缺血再灌注造成的移植肠损伤，所有动物及移植肠术后两周
14、全部成活，表四。表4 各组移植肠术后两周存活率n 与另两组相比P = 0 0 0 1讨论小肠粘膜上皮细胞对缺氧高度敏感，因此供肠的保存十分困难。移植过程中的冷保存和再灌注可以造成严重的缺血再灌注损伤，并可以导致移植术后诸多并发症，如原发性移植肠无功能、内毒素血症、腹膜炎和急、慢性排斥反应。缺血再灌注损伤的机制目前尚未完全阐明。研究表明缺血再灌注损伤在一定程度上是由活性氧代谢产物和异常聚积的多形核白细胞介导的。这一复杂生理过程可以由诸如胰蛋白酶、磷脂酶A 2 、N O 、二胺、钙内流调节剂、腺苷和与多形核白细胞活化有关的过程介导。有关小肠缺血再灌注损伤的研究已经明确N O 是一潜在介质。尽管有研
15、究认为N O 在缺血再灌注损伤中起着有害的作用，但绝大多数研究均表明N O 可以减轻缺血再灌注损伤。L 精氨酸是体内N O 的底物。在辅助因子黄素单核苷酸核亚铁血红素存在时L 精氨酸与氧分子作用产生N O 和瓜氨酸。该反应由N O 合成酶催化。动物实验发现补充L 精氨酸可以减轻心脏和肝脏的缺血再灌注损伤。在小肠移植，研究也发现再灌注前给予精氨酸可以改善移植肠结构和粘膜形态、屏障功能。众所周知，精氨酸可以刺激机体免疫系统，因此给受体注射【，精氨酸有可能干扰抗排斥治疗。在本研究中我们将L 精氨酸用于供体，希望通过供体L 精氨酸预处理提高移植肠对缺血再灌注损伤的抵抗能力。研究结果表明，在移植肠获取前
16、9 0 分钟给予供体低剂量L 精氨酸明显提高了移植肠的存活率，同时移植肠组织M D A 和M P O 含量的上升幅度也明显减小，移植肠上皮细胞凋亡也得到抑制，表明抗氧化和抗凋亡作用可能在其中发挥了一定作用。一1 9 7 盂宪民基金会首届学术讨论会暨第十二届全国普外基础与临床进展学术大会普外进展论坛实验中我们也测定了再灌注1 5 分钟后移植肠中N O 的含量( 数据未列) 。结果发现，缺血再灌注损伤引起了移植肠N O 含量的明显上升，但是L 广精氨酸预处理组与对照组N O 含量并无明显差异，推测其中原因可能是由于在供肠获取时血管床灌洗使移植肠中L 精氨酸含量明显降低，而长达8 小时的冷保存远远超过N O 的半衰期，因此各组间N O 的浓度差异不明显。这也提示L - 精氨酸预处理减轻缺血再灌输损伤的作用可能并非通过N O 的直接作用如扩血管和抗血小板聚集等，可
