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1、中华中医药学会第ll 届肝胆病学术会议论文集2 0 0 4 - 0 5 2 6的增殖和分泌胶原，而乙醛则有选择性地促H S C 分泌I 型胶原、F N ，其m R N A 表达增剃1 1 。乳酸和乙醛可刺激培养的狒狒肝成纤维细胞胶原的合成，而乙醇则无此作用【2 J 。目前，从乙醇的代谢及酒精性肝纤维化的形成机制方面考虑，我们选择乙醛作为致病源来进行体外实验研究。从实验中可以看出，在一定范围内细胞增殖与乙醛量是先增后减的量效关系。根据实验结果，选择8 7 5 1 a m M 浓度，细 胞的增殖率及生存率都达到了较高的峰值。以往实验表明，H S C 的增殖活化是肝纤维化形成的关键部分，酒精性肝纤维
2、化也不例外，H S C 在 肝纤维化发生中发生转化表现出肌样成纤维细胞( m y o f i b r o b l a s tM F b ) 的形态，M F b 与成纤维细胞 类似，成纤维细胞表达o 【平滑肌肌动蛋白，正常肝 组织中仅血管壁平滑肌呈阳性反应，随着H S C 激 活、转化，H S C 内脂滴及俄减少，粗面内质网和微丝丰富，胞浆伸展，细胞成星形、纺锤形，胞浆中微丝束增多，从胞核向细胞膜呈放射分布，结蛋白和仅S v I A 染色体阳性，激活H S C 能大量合成 E C M ，以往的研究表明，在乙醛作用下肝H S C 加倍地产生I 、I I I 型胶原、F N 也明显增多。F N 是最
3、早发现的一种多功能大分子非胶原糖蛋白，其功能较为复杂，可参与细胞的分化、间变、调理巨噬细胞吞噬功能，创伤愈合，炎症及凝血过程，肝纤维化时，它可促使成纤维细胞、窦内皮细胞在高浓度的纤维连接蛋白部位增生，分泌并沉积细胞外基质，使纤维化自行发展。F N 还具有较强的粘附作用，可使H S C 分泌的胶原与窦内皮细胞间粘附。以往众多研究均证实，乙醛是H S C 增殖因子，促使H S C 合成并分泌I 、I I I 型胶原及F I N ，本研究 通过细胞上清液的成分检测以及通过免疫组化方法均证实乙醛这一促合成作用，慢肝消可抑制这一过程，下调胶原及非胶原蛋白的合成分泌，进一步通过R T - P C R 方法
4、，从基因调控水平探讨慢肝消的作用机理，研究结果表明，慢肝消可在转录水平抑制星状细胞合成分泌I 、I I I 型胶原和F N 。综合以往的整体动物实验研究，从整体动物肝脏一离体H S C水平，慢肝消对细胞外基质的过量沉积有明显的抑制作用。通过理论总结，我们初步认为，酒精性肝纤维化属中医学的“酒癖”范畴，病机为“肝脾不和、痰瘀内阻“ ，其中脾气虚为其实质，、病位在肝、脾， 涉及胆、胃、证多虚实夹杂，治疗以肝脾同调，虚实同治为原则。慢肝消以调肝健脾、活血化瘀，解毒消积为治法。临床观察和实验结果较一致。 参考文献I C a s i n iAc ta 1 A c e t a l d e h y d eI
5、 n c r e a s e sP r o c o l l a g e nT y p eIa n dF i b r o n e e t i nG e n eT r a n s c r i p t i o ni nC u l t u r e ，dR a tF a t s t o r i n gC e l l st h r o u g haP r o t e i nS y n t h e s i s d e p e n d e n tM e c h a n i s m H e p a t o l o g y1 9 9 1 ；1 3 ( 4 ) ：7 5 8 - 7 6 52 S a v o l a
6、 n e nE Re ta A c e m l d e h y d ba n dl a c t a t eS t i m u l a t eC o l l a g e nS y n t h e s i so fC u l t u r e dB a b o o nL i v e rM y o f i b m b l a s t s G a s t r o e n t e r o l o g y1 9 8 4 ；8 7 ：7 7 7 8 7国家自然科学基金( 3 0 0 7 0 9 3 9 ) 及教育部重点课题资助清毒汤对大鼠实验性肝损伤内毒素血症的治疗作用高连印1 王融冰2 车念聪1 付修文1
7、江宇泳2 杜宇琼1 鞠大宏3 1 首都医科大学中医药学院( 1 0 0 0 )2 北京地坛医院3 中国中医研究院重型肝炎、慢性肝衰竭病人死亡率高达7 0 左右，其死亡原因与感染、内毒素症成正相关。临床研究证实在综合疗法基础上加用清毒汤( 治疗组) 可缩短内毒素血症时间，快速缓解肠源性内毒素相关的发热、腹胀等症状，对抗内毒素所致的肝损害，提高重型肝病好转率，其疗效显著优于对照组( 综合疗法加用乳果糖) ，在降低血氨方面也有较好作用。本研究拟探讨该药清除内毒素的药理机制。l 材料与方法1 1实验动物选用S D 大鼠3 8 只。体重2 0 0 9 - 2 2 0 9 ，雌雄兼用，清洁级。由北京维通利
8、华实 验动物技术有限公司提供，许可证号：S C X K ( 京)2 0 0 2 0 0 0 3 。大鼠饲养和实验均在中国中医研究院基础理论研究所清洁级实验动物室内进行( 实验动 物室许可证号：S Y X K l1 o o 0 0 3 9 ) 。1 2药物清毒汤：由北京地坛医院提供。常规1 2 9中华中医药学会第l l 届肝胆病学术会议论文集水煎制，生药含量为1 1 9 m l 。乳果糖：云南善美制 药有限责任公司生产，批号：0 2 0 6 0 1 。临用前用蒸馏水将其稀释为O 1g m l 浓度的药液。1 3 主要试剂硫代乙酰胺：由北京化学试剂公司提供，批号：0 1 0 6 2 9 ；戊巴比妥
9、钠：北京通县育才精细化工厂生产，批号：9 5 0 4 2 7 ；鲎试剂盒：由上海伊化临床医学科技公司( 上海市医学化验所)提供，批号：2 0 0 2 0 6 0 2 ；丙氨酸氨基转换酶( A L T ) 、 天门冬氨酸氨基转换酶( A S T ) 试剂盒由R o c h e 公司提供；肿瘤坏死因子c t ( n 吓Q ) 放免试剂盒由北京北方生物技术研究所提供，批号：0 3 0 3 2 0 。 1 4 分组及处理将3 8 大鼠随机分为4 组：正常 对照组1 0 只，模型组9 只，清毒汤组9 只，乳果糖组l O 只。清毒汤组和乳果糖组分别灌胃给予清毒汤和乳果糖l m l 1 0 0 9 体重。l
10、 h 后腹腔注射硫代乙酰胺( T A A ) 6 0 0 m g k g 体重，分别于6 h 、1 2 h 后再次灌 胃给药。正常对照组、模型组处理方法同上，只是正常对照组、模型组灌胃给予同容积的蒸馏水，正常对照组腹腔注射等量的生理盐水。注射2 4h 后，将各组大鼠以4 5 m g k g 体重的戊巴比妥钠腹腔注射 麻醉，于腹主动脉无菌取血，分离血清、血浆，分别用于A L T 、A S T 、T N F Q 以及内毒素含量的测定。取肝脏，用1 0 福尔马林周定。1 5 指标测定1 5 1肝脏损伤情况的病理形态学观察：取肝脏，常规取材，石蜡包埋，H E 染色。光镜下对其进行病理形态学观察，并用Q
11、 w i n 图像分析系统测定其 损伤面积百分比。测定方法：在2 0 0 倍光镜下，随机选取l O 个视野，测损伤面积百分比，取平均值。 1 5 2 血清中A L T 、A S T 活性浓度测定：用日立7 1 7 0 全自动生化分析仪进行测定。1 5 3 血清中T N F Q 含量测定：按照试剂盒所附说明书，用G C 9 1ly 放射免疫计数器进行测定。1 5 4 血浆中内毒素含量测定：按照试剂盒所附说明书，用7 5 2 C 紫外可见分光光度计进行测定。 1 6 统计学处理计量结果皆以均数标准差( ；s ) 表示，采用方差分析进行检验。 2 结果 2 1 病理形态学观察正常对照组：肝脏结构正常
12、，被膜不增厚，小叶境界清晰，肝板以小叶中央静脉为中心，呈放射状排列。肝板为一个细胞厚度。肝窦未见扩张，亦无狭窄。肝叶实质细胞未见变性及坏死。中央静脉壁无增厚，门管区三管清晰可见，无淋巴细胞浸润，1 3 0未见结缔组织增生。间质细胞不增多。模型组：肝脏结构基本正常，被膜不增厚，肝小叶境界尚清晰，肝板未见增厚。肝实质可见多发灶状水泡变性及气球样变，并可见新鲜的点状、灶状、带状及桥联状坏死。坏死灶可见细胞碎片，并见中性粒细胞、少量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润。浸润之炎细胞可见退变及核碎裂。坏死灶内有处可见圆形嗜酸性小体。点、灶状坏死多见于中央静脉旁小叶下静脉周围，严重处小叶中心带呈带状坏死，坏死灶有时
13、可与邻近的中央带或周边带相连，构成桥连状坏死。乳果糖组和清毒汤组：两组病理所见与模型组相似，但点灶状坏死、中央带状坏死及桥连状坏死均较模型组为轻。进一步的图像分析结果显示，清毒汤组、乳果糖组的肝脏损伤面积百分比皆明显低于模型组，而 清毒汤组的肝脏损伤面积百分比明显低于乳果糖组，见表1 。表l 各组大鼠肝脏的损伤情况注：与模型组比较，P 0 0 5 , P o O 】；与乳果糖比较，P 0 0 5 。2 2 清毒汤对肝损伤大鼠血清中A L T 、A S T 活性浓度的影响模型组血清中A L T 活性浓度显著高于正常对照组。与正常对照组比较，清毒汤组、乳果糖组A L T 活性浓度均有增高的趋势，但
14、无统计学意义；与模型组比较，两组A L T 活性浓度皆有下降的趋势，但亦无统计学意义。与正常对照组比较，模型组、清毒汤组的A S T活性浓度明显增高，乳果糖组的亦增高，但无显著 性差异。与模型组比较，清毒汤组、乳果糖组的A S T 活性浓度明显降低。与乳果糖组比较，清毒汤 组的A S T 活性浓度有降低的趋势，但无显著性差异。以上结果见表2 。，表2 各组大鼠血清中A L T 、A S T 活性浓度的变化注：与正常对照组比较，岬 O 0 5 ，P O 0 1 ；与模型组比较，P 0 0 5 ，P 0 0 1 中华中医药学会第1 1 届肝胆病学术会议论文集2 0 0 4 0 5 2 62 3 清
15、毒汤对肝损伤大鼠血清中T N F - o 【含量的影响模型组大鼠血清中T N F Q 含量显著高于正常 对照组。清毒汤组、乳果汤组的T N F a 含量亦明显高予正常对照组，但明显低于模型组，见表3 。表3 各组大鼠血清中T N F Q 含量的变化注：与正常对照组比较，P 0 0 5 ，+ + P O 0 1 ；与模型组比较，6 P 0 0 5 6 P 0 01 。表4 各组大鼠血浆中内毒素含量的变化注：与正常对照组比较：+ P O 0 1 ：与模型组比较：P 0 0 1 ；与乳果糖比较：P 0 0 5 。4 清毒汤对肝损伤大鼠血浆中内毒素含量的影响表4 提示，模型组、清毒汤组以及乳果糖组大鼠
16、 血浆中内毒素含量较正常对照组均显著增高。清毒汤组、乳果糖组的内毒素含量皆显著低于模型组。 与乳果糖组比较，清毒汤组内毒素含量明显降低。 3 结论3 1清毒汤、乳果糖对T A A 所致的肝损伤均具有明显的保护作用，而清毒汤的作用明显要优于乳果糖。3 2 有研究显示，肝脏受损时，不能清除肠道来源的内毒素，从而形成“肠源性内毒素血症”。本实验结果表明，清毒汤、乳果糖对其均具有明显的治疗作用，而清毒汤的作用要明显优于乳果糖。3 3有研究表明，内毒素能刺激巨噬细胞产生T N F a ，而T N F a 能介导内毒素的作用并进一步造成肝损伤。本实验结果显示，清毒汤能使内毒素、T N F a 含量均明显降低。这结果提示，清毒汤能使内毒素含量降低是其对T A A 所致的肝损伤具有保护作用的机理之一。黄芩甙对C o n A 致肝损伤小鼠肝组织M D A 含量的
