Western Blot为什么必须要用内参

《Western Blot为什么必须要用内参》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Western Blot为什么必须要用内参（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、Western Blot 为什么必须要用内参？为什么必须要用内参？一、 背景：GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由 4 个 3040kDa 的亚基组成，分子量 146kDa。GAPDH 基因几乎在所有组织中都高水平表达， 广泛用作 Western blot 蛋白质标准化的内参。GAPDH 检测。Western Blotting(检测条带大约 在 36kDa，稀释比例达 10，000 倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。注：因为 GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。在实验中， 可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品

2、在电泳前上样时产生的样品间的操作误 差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的 GAPDH 的含量来进行校正，所以 一般的 western 实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋 白含量与本样品的 GAPDH 含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样 品与样品之间的比较。反应：抗 GAPDH 单抗（clone 6C5）能够与鱼、蛙、鸡、兔、小鼠、 大鼠及人组织来源的 GAPDH 反应，但不能与酵母 GAPDH 反应。应用：GAPDH 检测。 Western Blotting(检测条带大约在 36kDa，稀释比例达 10，000 倍)、ELISA、亲

3、和纯化、免 疫荧光及免疫组化。图图示:抗 GAPDH 单抗（CatKC-5G4）检测心脏组织匀浆中的 GAPDH 水平。A-G 分别表 示不同实验来源的心脏组织匀浆。抗 GAPDH 单抗稀释比例为 1：10，000，HRP 羊抗鼠二 抗（CatKC-MM-1302）稀释比例为 1：1000。采用 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit 试剂盒及 X 胶片曝光显影。 摘要： 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是 Western Blot。因为 Western Blot 操作相对简单方便，既可以

4、定性分析表达产物，同时还可 以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候 Western Blot 做起来很简单，可不顺的 时候也很令人心烦做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题 还是二抗有问题啦毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象 1+1 那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的 不确定性的。所以，严谨的 Western Blot 实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果 分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在， 而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量 Marke

5、r（用来确定蛋白条带对 应的分子量大小） ，空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照） ，已知量 标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做 Western Blot 往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果即便有结果也可能影 响结果的分析。 内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用 Western Blot 比较不同条件下或者不同组织 中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表 达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。内参即是内部参 照（Internal Control） ，对于哺

6、乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平 变化时常用它来做参照物。在 Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定 量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检 测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但 是，国内仍有不少科研人员在 Western Blotting 实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度

7、测定 作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法， 都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如 UV 法直接定量，适合 测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行 物质的干扰，如 DNA 的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度 一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA 法与 Lowry 法都容易受到蛋白质之间 以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰 Lowry，BCA 反应的还原 剂（如 DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的

8、，其最主要的缺点是不同的 标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需 要等量上样，此步骤也存在操作误差。在 Western blotting 实验时使用内参，即可简便地对 定量和上样步骤产生的误差进行校正。在 Western Blotting 中使用内参其实就是在 WB 过程中的另外用内参对应的抗体检测内 参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达 相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更 为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个 Western Blot

9、显色或者发光体系是否正常。 实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别 检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值 即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得 到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测 样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行 Western Blotting 实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分 析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种

10、 严谨的工作。 常用的蛋白质内参有 GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白 beta-actin 或 beta-tubulin。最近的国外文献报道中使用 GAPDH 内参的较多。上海康成生物 工程有限公司与国外实验室合作开发的 GAPDH，100l 一支，浓度为 100g/100l，稀释 比达 1：10000 以上，至少可做 100 次 Western mini-blots，价格仅为 988 元人民币，并且只 需 4保存运输，有效期长达两年。这一产品大大降低了内参的费用，性能稳定、质量可 靠、易于保存。 在 Western

11、Blotting 实验过程中，由于使用的二级抗体往往会与总蛋白中本身含有的 某些免疫球蛋白产生反应产生较强信号的杂带。因此，上海康成生物工程有限公司推出了 HRP 标记的 GAPDH，在任何情况下使用它都能够得到单一的条带结果，使得内参的使用 方法更为简便准确。这种操作省时，无需二级抗体反应的 HRP 标记的 GAPDH 内参不仅具 备康成生物普通 GAPDH 的所有优点而且结果条带单一，可避免二级抗体的非特异性反应。 售价为 1498 元人民币 100l，稀释比达 1：10000 以上，至少可做 100 次 Western mini- blots。图示: A-G 分别表示不同实验小鼠心脏蛋白

12、（上样量 50ug） ，兔抗小鼠 Akt 抗体（康成 生物 CatKC-5A01）检测心脏组织匀浆中 Akt 水平。加入兔二抗（康成生物 CatKC- RB-035，稀释比例为 1：5，000）时同时加入 HRP 标记的抗 GAPDH 单抗（稀释比例为 1：10，000，康成生物 CatKC-5G5） 。采用化学发光试剂盒（康成生物 CatKC-420）及 X 胶片曝光显影。一次反应即可同时检测目的蛋白（Akt）与内参 GAPDH 的含量。 目前，市场上供应的其他内参则均需要-20保存，干冰运输：Sigma 公司的 Anti- Actin， 价格为 241 美元 200l，可做 100 次左右

13、的 Western mini-blots。Labvision 的 - Actin 399 美元 1ml， 可做 50 到 100 次 Western mini-blots; 209 美元 0.5ml，可做 25 到 50 次 Western mini-blots。Cell Signaling Technology 的 BETA-ACTIN ANTIBODY 只可做 10 次 Western mini-blots，美金价为 150 美元，人民币售价为 1875 元。 附：在 Western Blotting 实验过程中使用内参的方法有： 一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入 HR

14、P 标记内参抗体，按照正常 操作即可。 二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进 行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用 Strip 缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参 蛋白的抗体温育、显色检测。 三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在 转膜后预染，根据蛋白质 Marker 的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白 与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育 以及显色。 二、 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是 Western B

15、lot。因为 Western Blot 操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候 Western Blot 做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象 1+1 那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的 Western Blot 实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠

16、腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量 Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做 Western Blot 往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在 Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用 Western Blot 比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提